敏感毒力基线是获得某个敏感纯合子的昆虫种群对某种杀虫剂的毒力回归线。毒力回归线又称剂量对数死亡概率值回归直线（LD-p线）。可用y＝a＋bx来表示，其中y为概率值，x为浓度对数，a值是截距，b值是回归直线的坡度（slope），b值也是分散程度的代表数值。b值越大，则分散程度越小，即这一群体对杀虫剂的反应较为均匀。反之，b值越小，分散程度越大，这一群体有更大的异质性，其抗药性之间的差异较大。任何一种抗性监测方法在推广应用前，必须建立可靠的敏感毒力基线，只有具备了敏感基线，才能确定区分剂量，才能准确地判断媒介害虫种群是否已经产生抗药性及抗药的程度和范围。诊断剂量也称区分剂量，为用来杀死一种昆虫群体中所有敏感个体，而几乎不杀死该群体中表现型抗性个体（包括抗性杂合子和抗性纯合子个体）的某一杀虫剂的剂量。依据WHO以及蚊虫抗药性检测方法国家标准，一般以2倍LC99或LC99.9值区别抗性和敏感种群。
LC99或LC99.9是由敏感品系的敏感基线计算得到的与死亡率99％或99.9％相对应的杀虫药剂剂量值。诊断剂量法是联合国粮食及农业组织建议用于害虫抗性田间监测的方法，它可以区分种群抗性个体和敏感个体，能监测种群中抗性个体频率的微小变化，无论是用于早期诊断还是抗性治理措施的效果评估，都比致死中浓度（LC50）或致死中量（LD50）更灵敏、准确。
目前，库蚊抗药性的监测和研究报道较多，但有关按蚊抗药性的监测和研究较少。由于缺乏中华按蚊（Anophelessinensis）的实验室敏感品系，且实验室驯化困难，影响了我国相关抗药性监测工作的开展和有关研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试昆虫供试中华按蚊，引自中国疾病预防控制中心（CDC）寄生虫病预防控制所，1960年代饲养至今，未接触过任何杀虫剂，在本实验室饲养至第6代后作为供试虫种。
1.1.2 实验室饲养条件室温（28±1）℃，相对湿度（70±5）%，每天光照约为12h。使用脱氯水（恒温室内放置24h以上的自来水）。
1.1.3 供试药剂拟除虫菊酯类杀虫剂：
98%溴氰菊酯、97%高效氯氰菊酯、95%氯菊酯；有机磷类杀虫剂：
95%杀螟硫磷、91.56%双硫磷、95%敌敌畏；氨基甲酸酯类杀虫剂：
95%仲丁威。所有杀虫剂原药均由中国CDC传染病预防控制所媒介生物控制室提供。
丙酮（苏州市三杰化学品科技有限公司）、乙醚（常熟市杨园化工有限公司）、矿物白油（国药集团化学试剂公司），均为分析纯级。
1.1.4 实验仪器CLIMACELL系列人工气候箱（MMMMedcenterGmbH）、Sartorius电子天平（德国赛多利斯）、海尔普通家用冰箱。
1.2 抗药性测定方法
1.2.1 幼虫测定方法蚊幼虫的抗药性检测最常用的方法是幼虫药液浸渍法，又称兴奋度测定，为WHO推荐使用的生物测定方法。通过毒力回归线和区分剂量2种方法可以测定幼虫敏感程度，对抗药性做出评估。测定步骤：每个药物确定5～6个浓度梯度，观察各浓度组死亡数，计算LC50。每只搪瓷碗放入199ml脱氯水，分别加入1ml不同浓度杀虫剂丙酮液并搅拌混匀，合计成200ml水溶液。再将50条Ⅲ龄末Ⅳ龄初幼虫倒入搪瓷碗内。静置24h后观察实验结果，检查死亡数。实验设置了对照组，即用1ml丙酮加入到199ml脱氯水中作为空白对照。实验重复3次。若化蛹率超过10%，对照组死亡率＞20%，实验无效重做。实验期间室温保持在27℃左右。幼虫死亡判断标准：用利器轻触幼虫呼吸管，不能运动或仅对刺激做微小反应（抽搐）并且不能主动逃逸避免刺激的持续发生，判定为死亡。
1.2.2 成蚊测定方法滤纸接触法为Busvine所首创，曾被称为BusvineNash法。后又经WHO多次审定修改，现已被推荐为成蚊抗性测定的标准方法（WHO法）。药纸的配制：将白油和乙醚按1∶2比例混合作为溶剂。杀虫剂按需要量溶解其中，配成一定浓度，吸取2.14ml均匀滴于16.0cm×12.5cm的新华Ⅰ号滤纸上。
2h后，待溶剂挥发后即可使用。测定步骤：每个药物确定5～6个浓度梯度，观察各浓度组死亡数，计算LC50。吸取25个未吸血的雌蚊放入恢复筒内，然后抽开隔板，将恢复筒内的蚊虫吹入装有药纸的接触筒内，迅速关闭隔板，将筒放平，此时开始计算接触时间，接触1h后再次抽开隔板，将蚊虫吹入恢复筒内，再将隔板关闭，取下接触筒，将恢复筒直立，用浸有5%糖水的棉花团置于尼龙纱网上，保持在室温25～30℃，湿度（70±5）%的环境内。记录接触药纸1h击倒数，恢复饲养24h后检查死亡数。同时设立空白对照，实验重复3次。若对照组死亡率＞20%时，实验无效重做。成蚊击倒判断标准：试虫翻背，腹部向上。成蚊死亡判断标准：身体翻转、侧歪不能运动或四肢可以轻微颤动。
1.2.3 统计与计算用DPS6.5软件进行数据统计，记录处理虫数。通过分析获得LC50、LC95、LC99、95%置信限（95%CI）、毒力回归线的斜率b值及其标准差、值、自由度。若5%＜对照组死亡率/击倒率＜20%，用Abbott公式校正处理死亡率/击倒率（见公式）。并以LC50的95%CI是否重叠作为判断不同类型杀虫剂的毒力差异是否有统计学意义。
2 结果
2.1 实验室杀虫剂对中华按蚊敏感品系幼虫的相对敏感基线和区分剂量测定实验室拟除虫菊酯类药剂溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氯菊酯对中华按蚊敏感品系幼虫的相对敏感基线LC50及其95%CI分别为0.0086（0.0066～0.0115）、0.0101（0.0089～0.0115）和0.0633（0.0541～0.0755）mg/L；有机磷类杀虫剂敌敌畏、杀螟硫磷、双硫磷的相对敏感基线LC50及其95%CI分别为1.1918（1.1184～1.2721）、0.1150（0.1107～0.1192）和0.0564（0.0531～0.0596）mg/L；氨基甲酸酯类杀虫剂仲丁威的相对敏感基线LC50及其95%CI为0.2709（0.2617～0.2825）mg/L（表1）。中华按蚊实验室敏感品系幼虫对不同杀虫剂的敏感度由高到低依次为溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、双硫磷、氯菊酯、杀螟硫磷、仲丁威、敌敌畏。
实验室拟除虫菊酯类药剂溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氯菊酯对中华按蚊敏感品系幼虫的区分剂量分别为0.0678、0.2432和0.4208mg/L；有机磷类杀虫剂敌敌畏、杀螟硫磷、双硫磷的区分剂量分别为4.3914、0.4962和0.3570mg/L；氨基甲酸酯类杀虫剂仲丁威的区分剂量为0.8738mg/L（表1）。
2.2 实验室杀虫剂对中华按蚊敏感品系成蚊的相对敏感基线和区分剂量测定实验室拟除虫菊酯类药剂溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氯菊酯对中华按蚊敏感品系成蚊的相对敏感基线LC50及其95%CI分别为0.0091（0.0081～0.0104）、0.0184（0.0163～0.0209）和0.0516（0.0400～0.0686）mg/L；氨基甲酸酯类杀虫剂仲丁威的相对敏感基线LC50及其95%CI为0.0186（0.0174～0.0199）mg/L（表2）。中华按蚊实验室敏感品系成蚊对不同杀虫剂的敏感度由高到低依次为溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、仲丁威、氯菊酯。
实验室拟除虫菊酯类药剂溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氯菊酯对中华按蚊成蚊的诊断剂量分别为0.0780、0.2152和0.7718mg/L；氨基甲酸酯类杀虫剂仲丁威的诊断剂量为0.1064mg/L（表2）。
2.3 WHO推荐的几种常用杀虫剂对按蚊成蚊的区分剂量结果见表3。拟除虫菊酯类杀虫剂中，按蚊成蚊接触高效氯氰菊酯4h的诊断剂量为0.05%，接触氯菊酯1h的诊断剂量为0.75%，接触溴氰菊酯1h的诊断剂量为0.05%；氨基甲酸酯类杀虫剂中，按蚊成蚊接触仲丁威1h的诊断剂量为0.10%。
3 讨论
媒介按蚊杀虫剂对敏感性监测是蚊虫防治工作的重要部分之一。各地在大规模使用杀虫剂前应收集测试基线资料。尚无基线资料的地区，可用实验室饲养多年的敏感品系替代进行测试。杀虫剂敏感性监测工作量很大，且对实验蚊虫数量有较高的要求，因此目前我国开展此项监测的省份并不多。本实验室中华按蚊引自中国CDC寄生虫病预防控制所实验室饲养50年以上的虫种，未接触过任何杀虫剂，且该原始种群来自于上海市南汇区，因此可认为该中华按蚊为上海本地敏感种群。通过对该种群进行幼虫和成蚊的常用杀虫剂测定，初步得到了中华按蚊幼虫和成蚊对常用杀虫剂的相对敏感度基线和诊断剂量。
由于中华按蚊属于较难驯化饲养的蚊种，国内长期饲养中华按蚊的实验室也较少，查阅各种文献，尚未得到有关某些杀虫剂对中华按蚊幼虫和成蚊的敏感基线或诊断剂量。参照WHO推荐的几种常用杀虫剂对按蚊成蚊的区分剂量（表3），可以发现本实验室中华按蚊成蚊除了对高效氯氰菊酯的区分剂量与WHO推荐的有所不同，对于仲丁威、氯菊酯和溴氰菊酯3种杀虫剂的区分剂量基本与WHO推荐值相同。因此，本研究得出的敏感度基线和区分剂量的测定结果可以作为我国中华按蚊成蚊区分剂量的参考值，应用于我国中华按蚊成蚊的抗性监测中。衡量一个敏感种群及其相对敏感毒力基线除了要比较其LC50值外，b值的大小是另一个重要指标。一般敏感毒力基线的b值多数都＞2。本实验室中华按蚊敏感品系对几种常用杀虫剂的毒力回归线b值都在2以上，说明该品系对各杀虫剂反应的异质性是比较低的。如果b值较小，这样的种群就不是同源敏感种群，其毒力回归线一般也不能作为敏感毒力基线。由于WHO没有推荐常用杀虫剂对按蚊幼虫的区分剂量，而本实验室中华按蚊成蚊的测定结果与WHO推荐值较为接近。因此可认为本实验室的中华按蚊为同源敏感种群，幼虫对各杀虫剂的毒力测定结果也可作为区分剂量的参考值，应用于中华按蚊幼虫的抗性监测中。
本实验过程中，由于没有常用杀虫剂对该蚊种的基线资料，因此对于各杀虫剂的浓度都要进行逐一摸索。对于每个药物的测定，首先扩大药物浓度范围进行初测，随后根据初步测定结果，进一步缩小浓度设置范围，常以等差或等比数列设置测试浓度，经过反复测试，找到每个药物的浓度区间。由于实验对于幼虫和成虫的受试要求有限定，故对饲养有较严格的要求，需要同一时期饲养大量的蚊虫，且要求虫龄齐整，发育完好，以保证一种药物的测试所用蚊虫是同一批次、同一生态环境，使外界干扰因素降至最低。饲养工作量大、繁琐，实验测试也需不断反复、调整，整个实验工作需占用实验人员大量的时间和精力。
常用杀虫剂对中华按蚊的相对敏感度基线和区分剂量的初步建立，对于上海市及周边省市突发疫情时，进行方便、快速的抗药性测定，指导喷洒灭蚊用药浓度，使经济效益最大化。也可为全国其他省市作为一个参比标准。中华按蚊敏感毒力基线的建立过程虽然繁琐、复杂，耗费较大精力，但是作为研究抗药性规律与机制、制定抗药性治理策略等的基础与前提还是非常有意义的。
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