在放入含1 M的DMSO保存液中之前，以每次0.25M浓度逐级增加至1M,每增加一级平衡孵育5min,在最终浓度内平衡10min.采用同样的步骤进行DMSO的稀释。在放入DMSO之前或之后，在无DMSO的鱼Ringee液中平衡5min.
我们对完整的卵细胞进行了过冷点与冰点的测定，采用铜一康铜温差电偶记录过冷点和冰点的温度，指示部分采用国产AC15/2型直流复射式检流计，配备国产ZX21型旋转式电阻箱。
降温系采用自制简易降温仪（图1），致冷剂为碎冰和食盐的混合物，其原理是通过致冷剂冷却烧杯内的酒精，从而使样品致冷。由半导体温度计测量保存液的温度。在进行冷冻前与冷冻后，均以每5min增加或减少0.25M的步骤平衡受精卵（室温），而后放到简易降温仪内降温，降温曲线如图2所示。冷冻所达的温度分别为一6℃，一10℃，一15℃，并在其最低温度内保存10min.冷冻结束后，以10~20℃/min的复温速度解冻鱼卵（8℃），经过DMSO平衡之后移入水中激活，2小时后计数其直接成活率，孵化至发眼期，计数其发眼卵数。
冷冻卵活力的签定标准为：卵对水的活性或变硬处理有反应，则认为卵是活的；变得透明，不发生机械变形和产生卵周隙的卵，被认为是变硬的卵。
结果：
1.冷冻对受精卵孵化效果的影响：
在未冻结的保存液内，卵的外形直观上无变化，但当保存液有冰晶产生时，有些卵变白，解冻时，这些卵又变得清晰，但移到水中激活后，这些卵又重新变白。没有变化的卵，经水激活后形态正常。经冷冻保存之后的卵，透明度增高，卵细胞内，油滴多聚集在动物极之侧。
冷冻实验由于系分批进行，故全部实验数据均与相应的对照值相关。
冷冻组的样品从室温降至一5℃这一阶段，含有冷冻保护剂的保存液并未冻结，在保存液内形成冰晶时，温度上升至一4℃左右，其所持续的时间在1min之内。样品的中心重新冷至所需温度是以一0.2℃/min的速度进行的，并在最低温度保存l0 min,结果见表2.
2.过冷点与冰点的测定：本试验所测得的过冷点是不恒定的，其值均在 -7.5℃以上；但其冰点值均在-1.7 ~ -1.8℃之间（表3）。
讨论此次实验全部采用没被水激活的受精卵，据鱿鱼（Salmo Salar）的研究，就水透过卵黄外周膜而言，未激活比激活的卵渗透系数高，由此可知，冷冻期间未激活的卵可能脱水较好，因而胞内冻结而引起损害的几率最小。此外精子与卵子的细胞质接触后，由于未激活的卵受精过程被阻滞，所以这些卵子具有统一的发育期。
Zell、Erdahl和Grahum也曾用受精、但未激活的卵作冷冻研究。受精卵在体腔液或鱼Ringer液中保留有受精性，尽管在鱼Ringer液中能够受精，但只有将其移到新鲜水中时它才有活性和变硬。渗透压对受精卵的影响，可采用的资料有限，但从B、Harvey（1983）和J、Stoss（1983）的资料来看，其维持在240一450mosm可耐受24小时。本次试验我们所采用的鱼Ringer液的渗透压维持在250mosm左右。
冷冻前和冷冻后添加DMSO的主要目的是防止渗透冲击，使抗冻剂充分渗透。
抗冻剂的穿透性与该物质的分子量是成反比的。J、Stoss（1983）证明：冷冻前DMS0在2 M和4 M对银大马哈鱼卵有害，几乎不能存活，但含2 M的DMSO样品被冷冻至一11.8℃时，仍可观察到部分卵活到发眼期。逐步增加DMSO的浓度，可以减少或消除不利影响。冷冻保护剂可使细胞脱水时间更长，延缓细胞内冰的形成。现普遍认为IM的DMSO效果似乎较好，故此，我们所采用的DMSO浓度亦为1 M。
Harvey和Smith（1982）测得硬头缚卵的内容物和完整卵的冰点近似，其值均为一1.7℃，这与我们的结果相比是一致的。很多类型的细胞质在一1℃便结冻。蛙鱼卵的冰点较低，无异是由它们卵黄内容物高的缘故，过冷点值的不恒定，是与降温速度有关，降温速度越快，过冷状态越不稳定，过冷点越小，反之也是如此。
冷冻和解冻期间，存活率减少的主要原因是细胞内冰形成，而冷冻程序主要在于充分地脱去细胞内的水分，使细胞内冰形成的几率减至最小。
稀释液与卵细胞自然冻结的温度为一4℃，这与Harvey和Smith（1982）所得的结果是相近的。在一6℃DMSO有效地保护了结冰过程中的受精卵，然而进一步冷却至一15℃多数细胞内结冰，这说明所用的冷却速度使细胞脱水不充分，Mazur指出：适宜的冷却速度和细胞的直径大致是相关的。故此，我们所用的降温速度可能是不适合的。Zell（1978）在没有抗冻剂的情况下，以5℃/min的冷却速度将溪红点蛙受精卵降至一5℃，孵化率为20%,在含有抗冻剂（8%DMSO,10%PVP）的情况下，在相同条件下获得70%的存活率，Erdahl和Graham（1980）以5℃/min降温速度，在一20℃保存，持续时间不清，含14%DMSO或14%甘油的保存液中在16粒欧傅鱼卵中获得69%的发眼率，但在更低的温度下，没有获得成功。由于Zell（1978）每次试验使用的卵量较多（75~750），卵置于最低温度不到5 min,这样，样品内可能会产生温度梯度，中心温度可能未达到最低温度，所以这些结果与我们的资料相比是困难的。在我们的研究中多数卵细胞内冻结，因此在含有DMSO的保存液结冰之后，在一10℃~一15℃之间坏死，与Stoss（1983）的结果是较相近的。Harvey和Smith（1982）的研究结果也表明，在10%的DMSO的清况下，保存硬头蹲卵在一16℃，鱼卵细胞内亦结冰。最低温度时的存活率也是一样不能保证以后的发育率，这一点在我们的资料中也可体现出来。
总的来讲，寻求更慢的降温速度与合理的改变解冻速度及实验程序，使细胞内脱水更充分，可能使鱼卵的冷冻获得进一步的成功，有待于新的探索。
参考文献：
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