邻苯二甲酸酯作为增塑剂广泛用于各种塑料产品，以增加其可塑性和柔韧性。由于传统增塑剂如邻苯二甲酸二乙基己酯 （Di（2 - e thy lhexy1）phthalate,DEHP） 毒性较大[1],一些新型增塑剂正逐渐取而代之。邻苯二甲酸二异癸脂（DIDP） ,作为一 种 常 用 的 新 型 增 塑 剂，主 要 用 于 聚 氯 乙 烯（polyvinyl chloride,PVC）、食品包装袋、地板、家具、建筑材料和医疗设备中[2].DIDP能通过多种途径进入人体，如经口摄入、皮肤接触、呼吸暴露和注射暴露等。其中经口暴露是最为普遍的暴露方式。儿童由于长期接触可放入口中的PVC玩具，其暴露于DIDP等邻苯二甲酸酯的风险较大[3].研究发现，DIDP经口暴露可以引起实验动物的肝脏肿大[4],促进过氧化物酶体的增生，而过氧化物酶体的急剧增多与啮齿类动肝癌的发生相关[5].流行病学研究发现，邻苯二甲酸酯的暴露与儿童和塑料行业工人的过敏症高发率之间存在一定的联系[6,7].已有研究表明邻苯二甲酸酯可能作为佐剂对过敏反应产生影响[8],但目前DIDP对过敏性皮炎的影响及相关机制尚不清楚。
过敏性皮炎（allergic dermatitis,AD） 是一种由于反复接触抗原而引起的过敏性炎症性皮肤病。作为过敏性皮炎的一种，过敏性接触性皮炎（allergiccontact dermatitis,ACD） ,是一种在发达国家最常见的皮肤过敏症。研究发现，在这类过敏性皮炎的发病初期，Th2型细胞产生的IL - 4、IL - 5和IL - 13发挥着重要作用[9].Th2型细胞因子和Ig E的过量表达会进一步促进皮炎的发展[10].异硫氰酸荧光素作为一种半抗原，常被用来构建以Th2型细胞因子表达为主的ACD动物模型。氧化应激反应与多种炎症反应包括过敏性皮炎有关[11-12].褪黑素是松果体分泌的一种激素。一定浓度的褪黑素能高效清除自由基，减轻组织氧化损伤的程度[13-14],并具有一定的保健作用[15].
利用FITC构建小鼠过敏性皮炎模型，通过检测过敏性皮炎小鼠耳朵组织的肿胀程度和炎症因子含量探究增塑剂DIDP长期消化道暴露在FITC诱导的过敏性皮炎中的佐剂作用。同时，以抗氧化剂褪黑素为阻断剂，进一步探讨氧化应激在DIDP佐剂作用中的可能的介导作用。
1 材料与方法
1. 1材料 实验动物： 雄性Balb / c小鼠（6周龄左右，22 ~ 23g） 购于湖北省疾病预防控制中心，饲养在SPF级动物需要的屏障环境中，给予充足的水和食物。
试剂：DIDP（Sigma,纯度> 99%） ,邻苯二甲酸二丁 酯 （dibutyl phthalate,DBP） （Sigma,纯 度>99%） ,FITC（Sigma） ,丙 酮 （sigma） ,戊 巴 比 妥 钠（sigma） ,吐温- 80（Amresco） ,褪黑素（sigma） ,小鼠总Ig E酶联免疫试剂盒（Biolegend） ,小鼠IL - 4酶联免疫试剂盒（e Bioscience） ,小鼠IFN - γ酶联免疫试剂盒（e Bioscience） ,微量还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒（ 南京建成） ,活性氧（ROS） 检测试剂盒（ 南京建成）。
仪器： 低温冷冻离心机（Eppendorf - 5415R） ,超声处理器，三用电热恒温水箱，FL × 800荧光酶标仪（Bio - Tek,USA）。
溶液：①DIDP染毒液： 按照1:1的比例用吐温80对DIDP进行促溶，然后用生理盐水将促溶后的DIDP配置为20 mg / m L的原液，再用生理盐水稀释为0. 2、2、20 mg /m L的染毒液； 每天每只小鼠的DIDP灌胃量（m L） 与小鼠体重（g） 的比值是1:100,以保证最后的染毒剂量是2、20、200mg /kg /d;②0. 5% FITC: 按照0. 5%的质量体积比，以FITC作为溶质，以DBP和丙酮（1:1） 作为溶剂，充分混合后配置而成；③褪黑素： 先加无水乙醇（ 无水乙醇体积≤2%溶液总体积） 对褪黑素粉末进行促溶，然后加入所需体积的生理盐水配置成1 mg /m L的褪黑素溶液，现用现配；④麻醉剂：1. 0 g戊巴比妥钠溶于100m L高压灭菌生理盐水，配置成1%戊巴比妥钠麻醉剂，现用现配。
1. 2实验方法
1. 2. 1方法 将雄性Balb / c小鼠随机分为7个组，每组7只。具体分组如下：①生理盐水组（saline组） ;② 200 mg /kg /d DIDP组 （DIDP 200组） ;③FITC组；④FITC + 2 mg / kg / d DIDP组（FITC + DIDP2组） ;⑤FITC + 20 mg / kg / d DIDP组（FITC + DIDP20组 ） ;⑥ FITC + 200 mg / kg / d DIDP组 （FITC +DIDP 200组） ;⑦FITC + 200 mg / kg / d DIDP + MT组（FITC + DIDP 200 + MT组）。为了建立DIDP长期经口暴露模型，从实验开始的第1 d起用生理盐水或2、20、200 mg /kg的DIDP分别对各组雄性Balb /c小鼠进行灌胃，每天1次，同时，FITC + DIDP 200 +MT组小鼠每天还进行1 mg / m L褪黑素灌胃处理，连续灌胃21 d.在第22,23 d,在生理盐水组、DIDP200组小鼠的背部涂抹120 μL的对照溶剂（1:1丙酮/DBP） ,在FITC、FITC + DIDP 2、FITC + DIDP 20、FITC + DIDP 200和FITC + DIDP 200 + MT组小鼠的背部涂抹120 μL的0. 5% FITC进行致敏。第28d,将20 μL对照溶剂 （saline、DIDP 200组 ） 或者0. 5% FITC（FITC、FITC + DIDP 2、FITC + DIDP 20、FITC + DIDP 200、FITC + DIDP 200 + MT组） 涂抹于小鼠右耳进行激发，小鼠左耳涂抹20μL对照溶剂。
1. 2. 2血清样品制备 在第29 d,首先对小鼠进行麻醉，然后使用心脏穿刺方法进行心脏取血，收集血样，室温静置30 min后，离心（3 000 rpm,15 min,25℃） ,取上清，分装后保存于- 70℃待用。
1. 2. 3耳组织病理学检测 小鼠心脏取血后，引颈处死。用剪刀从小鼠耳朵根部剪下整个右耳，室温下放置于4%的多聚甲醛溶液中固定过夜，第2 d送往湖北百奥斯生物科技有限公司做小鼠耳朵组织的H&E染色切片，然后在显微镜下观察小鼠耳朵厚度的变化和炎性细胞如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的多少和聚集情况。
1. 2. 4耳组织匀浆的制备 称量小鼠右耳组织，放置于匀浆器中，加入适量预冷的PBS（p H = 7. 5） 进行研磨，制成5%的组织匀浆液，离心（10 000 rpm,10 min,4℃） ,取上清，分装后保存于- 70℃待用。
1. 2. 5炎症因子的检测 采用酶联免疫吸附法（enzyme - linked immuno sorbent assay,ELISA） 检测血清中Ig E含量以及耳朵组织匀浆中的IL - 4和IFN - γ的含量，灵敏度分别为15、4和15 pg / m L,具体步骤按照说明书进行操作。
1. 2. 6氧化应激水平的测定ROS的测定： 使用二氯荧光素（2',7'- Dichlorofluorescein,DCF） 荧光法检测耳组织中的ROS含量。将待测耳朵组织匀浆液用PBS稀 释50倍，二 氯 荧 光 素 双 醋 酸 盐（Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH - DA）荧光染料稀释500倍，各取100μL加入同一酶标孔中，在37℃下避光反应10 min后，用FLx 800荧光酶标仪检测其在488 nm激发光，525 nm发射光下的吸光值。GSH的测定： 用还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒来检测耳朵组织中GSH浓度，具体步骤按照说明书进行操作。
1. 2. 7统计学分析 实验数据用平均值±标准误表示。用Graph Pad Prism 5软件作图，SPSS 13. 0软件对数据进行统计学分析。采用单因素方差分析（one-wayANOVA） 检验组间均值的差异显着性，随后采用Tukeytest做两两比较，显着水平α定为P < 0. 05.
2 结 果
2. 1各组小鼠耳部组织病理学切片 小鼠耳组织的肿胀程度和病理学变化可以通过H&E染色的耳朵组织切片直观显示。通过观察和比较切片中耳朵组织的厚度可以初步判断其肿胀程度。另外，H&E染色将细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，可通过观察耳朵组织间质中的炎性细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的多少和聚集来判断耳组织的炎性细胞浸润情况，saline或高剂量的DIDP（DIDP 200） 单独作用不能使小鼠耳朵发生肿胀，也不能产生明显的耳组织病理学变化。但与saline组相比，FITC组的小鼠耳组织明显肿胀并出现了炎症细胞浸润。与FITC组相比，FITC + DIDP 200组的小鼠出现了更加严重的耳肿胀和炎症细胞浸润。与FITC + DIDP 200组相比，FITC + DIDP 200 + MT组的小鼠耳组织的肿胀程度和炎症细胞浸润现象明显减轻。
2. 2各组小鼠血清中的Ig E含量（ 图1） 与saline组相比，单独的DIDP经口暴露组（DIDP 200） 的小鼠血清中Ig E含量并无显着变化，但0. 5% FITC致敏组（FITC,FITC + DIDP 2,FITC + DIDP 20,FITC +DIDP 200,FITC + DIDP 200 + MT） 的小鼠血清中的Ig E含量显着升高（P < 0. 05或P < 0. 01）。与FITC组相比，FITC + DIDP 200组的小鼠血清中的Ig E含量显着上升（P < 0. 05）。与FITC + DIDP 200组相比，FITC + DIDP 200 + MT组的小鼠血清中的Ig E含量显着下降（P < 0. 01）。
