摘 要： 目的 分析慢性丙型肝炎患者抗核抗体谱(LIA-ANAs)的表达,探讨慢性丙型肝炎患者出现自身抗体的临床意义。方法 采用回顾性研究,选取2018年3—7月海军军医大学附属长海医院感染科门诊和住院收治的慢性丙型肝炎患者81例作为慢性丙型肝炎组,同时选取81例体检健康者作为健康对照组,检测2组LIA-ANAs、丙型肝炎病毒(HCV)-RNA载量及肝功能结果并进行统计学分析。结果 81例慢性丙型肝炎患者共37例检出LIA-ANAs,阳性率为45.67%,阳性率显着高于健康对照组的4.93%(4/81),差异有统计学意义(χ2=33.300,P<0.001)。30例(37.04%)患者检出1种特异性自身抗体,占LIA-ANAs阳性者的81.08%;6例(7.40%)检出2种特异性自身抗体,占LIA-ANAs阳性者的16.21%;1例(1.23%)检出3种特异性自身抗体,占LIA-ANAs阳性者的2.70%。81例慢性丙型肝炎患者中,ANA滴度≥1∶100共6例;24例HCV-RNA≥1×103 copies/mL。LIA-ANAs阳性和阴性组间HCV-RNA载量水平差异有统计学意义(χ2=4.645,P<0.05),2组丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的中位数差异有统计学意义,LIA-ANAs阳性组ALT和AST水平均高于阴性组(U=595.000、597.500,P=0.038 2、0.040 3)。81例慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs阳性和阴性组间年龄(t=0.720,P=0.479)、性别(χ2=0.400,P=0.520)差异无统计学意义。结论慢性丙型肝炎患者容易产生自身抗体,自身抗体的产生与性别、年龄无关,但与肝功能(ALT、AST)、HCV-RNA载量有关。对慢性丙型肝炎患者血清进行LIA-ANAs的检测,将有助于临床诊治的需求。
关键词： 丙型病毒性肝炎; 抗核抗体谱; 丙型肝炎病毒RNA;
Abstract： Objective To analyze the expression of anti nuclear antibody spectrum(LIA-ANAs)in patients with chronic hepatitis C and to explore the clinical significance of autoantibodies in patients with chronic hepatitis C.Methods In the retrospective study,81 patients with chronic hepatitis C were selected from the outpatients and inpatients in the Department of Infectious Diseases of Changhai Hospital of Naval Military Medical University from March to July 2018 as the chronic hepatitis C group,and 81 cases from physical examination healthy people were selected as the healthy control group,and the results of LIA-ANAs,hepatitis C virus(HCV)-RNA load and liver function were measured and analyzed statistically.Results The positive rate of LIA-ANAs was 45.67%,which was significantly higher than that of the control group(4.93%,4/81),the difference was statistically significant(χ2=33.300,P<0.001).One specific autoantibody was detected in 30 cases(37.04%),which accounted for 81.08% of the patients with positive LIA-ANAs;two specific autoantibodies were detected in 6 cases(7.40%),which accounted for 16.21% of the patients with positive LIA-ANAs;three specific autoantibodies were detected in 1 case(1.23%),which accounted for 2.70% of the patients with positive LIA-ANAs.Among 81 patients with chronic hepatitis C,6 patients had ana titer≥1∶100,24 patients had HCV-RNA≥1×103 copies/mL.There was a significant difference in HCV-RNA load between the positive and negative groups(χ2=4.645,P<0.05).The median difference in ALT and AST between the two groups was statistically significant,the levels of ALT and AST in the positive group were higher than those in the negative group(U=595.000,597.500,P=0.038 2,0.040 3).There was no significant difference in age(t=0.720,P=0.479)and gender(χ2=0.400,P=0.520)between the positive and negative groups of LIA-ANAs in 81 patients with chronic hepatitis C.Conclusion Patients with chronic hepatitis C are prone to produce autoantibodies.The production of autoantibodies is not related to gender and age,but related to liver function(ALT,AST)and HCV-RNA load.The detection of LIA-ANAs in sera of patients with chronic hepatitis C will be helpful for clinical diagnosis and treatment.
Keyword： hepatitis C virus; LIA-ANAs; hepatitis C virus RNA;
丙型肝炎病毒（HCV）是一种嗜肝RNA病毒。慢性HCV感染可导致肝细胞自身免疫性抗原表位暴露而诱发自身免疫系统疾病。自首次在自身免疫性肝炎患者血清中检出HCV特异性抗体以来，HCV感染与自身免疫的关系越来越受到临床关注[1]。同时，长期存在的自身免疫功能紊乱可能是诱发肝细胞恶变的原因之一。有文献报道，70%以上HCV感染者可出现自身抗体，包括抗核抗体（ANA）、胰岛素相关抗体、甲状腺过氧化物酶抗体等[2,3]。然而，HCV感染者抗核抗体谱（LIA-ANAs）的表达鲜有报道。本研究通过回顾性分析临床确诊的慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs的分布及其与性别、年龄、HCV-RNA载量、肝脏功能等的关系，旨在探讨慢性丙型肝炎患者出现自身抗体的临床意义，为进一步诊断、治疗及预后判断提供依据。
1、 资料与方法
1.1、 一般资料
根据临床诊疗结果及实验室检测指标进行回顾性分析。选取2018年3—7月海军军医大学附属长海医院感染科门诊和住院收治的慢性丙型肝炎患者血清标本81例作为慢性丙型肝炎组，其中男性48例（59.3%），女性33例（40.7%）；年龄24～86岁，平均（51.4±10.6）岁。同时选取81例体检健康者作为健康对照组，其中男性45例（55.6%），女性36例（44.4%）；年龄24～86岁，平均（52.1±11.3）岁。2组在性别、年龄上差异无统计学意义（P>0.05）。
1.2、 病例纳入、排除标准
所有慢性丙型肝炎病例的临床诊断均符合中华医学会肝病学分会、中华医学会传染病与寄生虫病学分会2015版《丙型肝炎防治指南》的相关标准[4]，即HCV感染超过6个月，或有6个月以前的流行病学史；HCV抗体（抗-HCV）及HCV-RNA阳性，肝脏病理学检查符合慢性肝炎。排除其他病毒性肝炎、药物性肝炎及自身免疫性疾病。
1.3、 仪器与试剂
北京科美生物技术有限公司提供的CHEMCLIN 1500全自动化学发光仪、EUROStarⅡ荧光显微镜、EUROBlotMaster 44半自动免疫印迹仪、EUROLINEScan扫描仪、日立7600型全自动生化分析仪、罗氏Cobas 4800荧光定量PCR仪。化学发光法检测试剂采用北京科美生物技术有限公司HCV-IgG化学发光免疫检测试剂盒（试剂盒批号：20180428）。间接免疫荧光法检测试剂采用欧蒙（杭州）医学实验诊断有限公司生产的ANA间接免疫荧光试剂盒（试剂盒批号：CF180506AB）。免疫印迹法检测试剂采用欧蒙（杭州）医学实验诊断有限公司生产的LIA-ANAs试剂盒（试剂盒批号：D180503AA）。生化指标检测采用上海科华生物工程公司生产的相应试剂盒。HCV-RNA定量检测采用上海科华生物有限公司提供的HCV-RNA荧光定量PCR检测试剂盒（试剂盒批号：18022511）。
1.4、 方法
1.4.1、 样本采集与保存
符合上述标准的人群采用真空采血管按常规采血步骤采清晨空腹静脉血3mL,1h内以3 000r/min离心分离血清并检测。未能及时检测的样本分离血清后-20℃保存，7d内检测完毕。
1.4.2、 HCV-IgG检测
采用北京科美生物技术有限公司HCV-IgG化学发光免疫检测试剂盒，操作完全按照试剂和仪器说明书进行，信号/阴性对照比值（S/Co）≥1为阳性。HCV-IgG质控品由上海市临床检验中心提供，HCV-IgG化学发光法室内质控批号：1801、1802。
1.4.3、 免疫印迹法检测LIA-ANAs
该试剂膜条可同时检测以下15种自身抗体：nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、着丝点蛋白B(CENP B）、增殖细胞核抗原（PCNA）、双链DNA(dsDNA）、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白（rRNP）、线粒体-M2(AMA-M2）的抗体。其中CENP B、PM-Scl、Ro-52、PCNA为重组抗原，其余均为经亲和层析纯化的天然抗原。待检血清1∶100倍稀释后进行检测，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。靶抗原部位出现棕色条带，即为该自身抗体阳性。
1.4.4、 ANA检测
采用德国欧蒙公司提供的ANA间接免疫荧光法检测。待检血清样本1∶100倍稀释后进行检测，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。每次试验均设阴性和阳性对照。在EUROStarⅡ荧光显微镜下观察荧光模式和荧光强度。ANA≥1∶100为阳性。
1.4.5 、HCV-RNA检测
采用上海科华生物有限公司提供HCV-RNA荧光定量PCR仪检测，HCV-RNA检出限为1×103 copies/mL。所有操作步骤均严格按照说明书进行。HCV-IgG质控品由上海市临床检验中心提供（HCV-RNA质控品批号：1801、1802）。
1.4.6、 丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测
采用速率法，检测试剂盒购自上海科华生物工程公司，仪器为日立7600型全自动生化分析仪。
1.5、 统计学处理
采用Graphpad Prime 5统计软件进行分析。正态分布及近似正态分布的计量数据以表示，2组间均数比较使用独立样本t检验；检测数据为偏态分布，数据以中位数（四分位数）[M(P25,P75）]表示，2组间比较采用MannWhitney U检验。计数资料以例数或率（%）进行描述，采用χ2检验进行统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 、结果
2.1、 LIA-ANAs在慢性丙型肝炎患者血清中的检出情况
81例慢性丙型肝炎患者标本中，共检出LIA-ANAs阳性37例（45.68%），阳性率显着高于健康对照组4.94%(4/81），且差异有统计学意义（χ2=33.300,P<0.001）。30例患者（37.04%）检出1种自身抗体，占LIA-ANAs阳性者的81.08%(30/37）；检出2种自身抗体6例（7.40%），占LIA-ANAs阳性者的16.21%(6/37）；检出3种自身抗体1例（1.23%），占LIA-ANAs阳性者的2.70%(1/37）。81例慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs阳性和阴性组间年龄（t=0.720,P=0.479）、性别（χ2=0.400,P=0.520）差异无统计学意义。LIA-ANAs具体检出情况见表1。
2.2、慢性丙型肝炎患者血清ANA的检出情况
81例慢性丙型肝炎患者血清ANA阳性6例，其中均质型1例，胞浆型2例，核仁型2例和颗粒型1例，见表2。然而，1例胞浆型和1例核仁型血清未检出LIA-ANAs。
表1 慢性丙型肝炎患者和健康对照人群HCV抗体水平及LIA-ANAs表达
表2 6例ANA阳性慢性丙型肝炎患者ANA检出情况
注：-表示此项未检出LIA-ANAs。
表3 LIA-ANAs阴性组及阳性组年龄、性别、肝功能及HCV-RNA载量的比较
2.3、 慢性丙型肝炎患者HCV-RNA载量、性别、年龄、肝功能与LIA-ANAs的关系
81例慢性丙型肝炎患者中57例HCV-RNA<1×103 copies/mL,24例HCV-RNA≥1×103 copies/mL。LIA-ANAs阳性组和阴性组间HCV-RNA载量的差异有统计学意义（χ2=4.645,P<0.05）。LIA-ANAs阳性组HCV-RNA载量高于阴性组。81例慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs阳性和阴性组间年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05);2组ALT和AST的中位数差异有统计学意义（P<0.05),LIA-ANAs阳性组ALT和AST水平均高于阴性组，差异有统计学意义（U=595.000、597.500,P=0.038 2、0.040 3）。见表3。
3、 讨论
大部分急性丙型肝炎患者会转变为慢性病毒感染，反复慢性炎症的作用导致肝纤维化，并引起机体内环境的紊乱，最终发展成为肝硬化，甚至肝细胞癌。近些年的研究表明，HCV感染参与了自身免疫和免疫耐受平衡的破坏，促使致病性自身抗体的产生，从而引发自身免疫反应，肝脏组织纤维化的发生、发展与此密切相关[1]。在HCV感染者中已经揭示了一些与肝脏慢性感染相关的肝外表现，其中大多数可以通过免疫学机制介导，而不与肝外组织的直接感染有关，如类风湿关节炎、甲状腺功能紊乱及自身免疫性肝病[5,6,7]。目前的研究报道对慢性丙型肝炎患者体内自身抗体与年龄、性别、肝功能及病毒载量等因素的相关性观点不一致[8,9,10]。大部分的研究主要集中在丙型肝炎与ANA、平滑肌抗体的相关性研究[11,12]，与LIA-ANAs的相关性研究较少见。
本研究发现，在81例慢性丙型肝炎患者中共37例检出LIA-ANAs，阳性率为45.68%，与AMICO等[12]的报道比较一致；且显着高于健康对照人群。在LIA-ANAs阳性慢性丙型肝炎患者中绝大部分（81.08%）仅检出1种自身抗体；检出2种自身抗体的仅占16.21%；检出3种自身抗体的比例则更低。然而，81例慢性丙型肝炎患者中ANA阳性仅6例（7.4%），与LIA-ANAs 45.67%的检出率明显不符，可能与ANA间接免疫荧光法检测的灵敏度较低有关。本研究还发现1例ANA胞浆型和1例核仁型患者血清均未检出LIA-ANAs，这是否表明本研究所使用的15种LIA-ANAs尚不足以覆盖慢性丙型肝炎患者体内产生的ANA种类？需要进一步扩大病例数来验证。
在所有检出的LIA-ANAs中Ro-52检出率最高，在37例LIA-ANAs阳性患者中检出Ro-52抗体有24例，比例高达64.86%。Ro-52是TRIM蛋白家族成员，在机体抗病原微生物等感染的固有免疫中起重要的调节作用；在细胞内可与多种分子相互作用，在核内可与DNA相互作用，发挥调节细胞增殖、凋亡、信号转导等功能[13,14]。当免疫调节系统某些环节出现紊乱，表现出免疫自稳机制破坏，使Ro-52存在的微环境失衡，从而导致多种自身免疫性疾病发生，如干燥综合征、系统性红斑狼疮、皮肌炎等[15,16]。有研究分析了10年内北美地区Ⅰ型自身免疫性肝炎患者的流行病学资料发现，患者Ro-52抗体的阳性率高达37.3%[17]。在自身免疫性肝病中Ro-52抗体是患者出现肝损伤的原因还是结果，目前仍存在争议。这些出现Ro-52抗体的丙型肝炎患者是否会出现严重的肝损伤？需要后续积累更多的病例加以分析。
慢性丙型肝炎患者自身抗体的出现，是否与病毒载量存在相关性，这对于患者的诊断和治疗均较为重要。通过本研究分析发现慢性丙型肝炎患者中LIA-ANAs阳性者HCV-RNA载量明显高于阴性者，可能是HCV感染可导致肝细胞膜通透性增加或细胞膜抗原成分发生变异，诱发机体产生自身抗体所致[18]。这些自身抗体的存在是否诱发了机体免疫系统对肝细胞的免疫损伤或出现自身免疫和病毒感染破坏的叠加损伤？本研究发现慢性丙型肝炎LIA-ANAs阳性者血清ALT和AST水平高于参考区间的比例明显高于阴性者，提示LIA-ANAs存在可能是引起肝脏组织损害的一个重要因素，也是导致肝外病理表现的原因。
4 、结论
在临床上自身免疫性肝病与慢性丙型肝炎在治疗原则上截然不同，如不恰当地使用干扰素治疗可使自身免疫性疾病病情恶化，而盲目地应用免疫抑制剂又可加重患者的病毒血症。因此，如何正确判断是合并HCV感染的自身免疫性肝病，还是伴有自身免疫现象的慢性丙型肝炎，这对于疾病的诊断和鉴别诊断、患者的治疗方向等有着极其重要的临床意义。对慢性丙型肝炎患者血清进行LIA-ANAs的检测，将有助于满足临床诊治的需求。
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