自噬（autophagy）是由 Ashford 和 Porter[1]在1962年发现细胞内存在“自己吃自己”的现象后提出，系指由细胞粗面内质网或高尔基体等脱落的双层膜包裹部分细胞质和受损的细胞器及蛋白质，而后与溶酶体融合降解其所包裹内容物，从而实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新[2].据研究[3 -5],自噬在细胞生长发育中起重要作用，且在各种应激及疾病如缺血缺氧性损害、肿瘤、神经退化等病理过程中也扮演着至关重要的角色。严重烧伤或创伤后易发生失血性休克，导致全身组织缺血缺氧，为保证心脑血管等重要脏器血流供应，机体常出现代偿反应，即血液重分布，在血液重分布情况下肠道又是最常受累的器官，由肠道组织灌流不足、氧需求增加及高代谢所造成的缺氧，导致肠黏膜结构与功能受损。缺血缺氧所致胃肠道上皮细胞的自噬情况目前研究甚少，本研究利用体外缺氧模型模拟胃肠道缺血缺氧，动态观察 Caco-2肠上皮细胞在缺氧条件下的自噬变化情况，旨在了解缺氧对肠上皮细胞自噬的影响，为研究自噬在缺氧后肠上皮损害中的作用奠定基础。
材料与方法
1 实验材料
Caco-2 肠上皮细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供，P62 抗体、Beclin1 抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自美国 SIGMA 公司，微管相关蛋白 1轻链 3（LC3）抗体购自美国 CST 公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗为美国 Southern Biotech 公司产品，绿色荧光蛋白（GFP）-LC3B 由第三军医大学生物医药中试研究基地唐彬博士赠送，改良伊格尔培养基（DMEM）及还原血清培养基（OPTI-MEM）均购自美国 Gibco 公司，胰蛋白酶购自 BBI 公司，常氧培养箱和缺氧培养箱均购自美国 Thermo Scientific公司，超敏化学发光检测试剂盒为 Advansta 公司产品，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜为 Millipore 公司产品，蛋白印迹相关试剂﹑蛋白测定试剂盒﹑电转仪﹑电泳仪及 ChemiDoc XRS 型凝胶图像分析系统均购自美国 Bio-Rad 公司，UD-201 型组织细胞超声破碎仪购自日本 TOMY 公司，冷冻离心机 AllegraTMX-22R购自美国 Beckman 公司，TCS SPS 型激光共聚焦显微镜为德国 Leica 公司产品，H-600 型透射电镜为日本日立公司产品。
2 细胞培养与处理
Caco-2 细胞用含体积分数为 10% 胎牛血清（FBS）、100μg/mL 链 霉 素、100U/mL 青 霉 素、2mmol / L 谷氨酰胺、1mmol / L 非必需氨基酸、pH7. 4的 DMEM 培养基培养，当细胞长至约 90% 融合时，用 25g/L 胰蛋白酶及 0. 53mmol/L 乙二胺四乙酸液消化，按 1 ∶ 3 比例传代培养。将细胞接种于 6 孔板，隔天更换培养液，直到细胞完全融合。将细胞接种于含盖玻片（鼠尾胶原包被）的 24 孔板，到细胞贴壁后处理。
细胞缺氧处理按照文献方法[6]进行，将细胞完全融合的 6 孔板放入缺氧培养箱中，充入由体积分数为 1%O2、5%CO2和 94% N2组成的混合气体（重庆朝阳气体厂），放置于 37°C 细胞培养箱中培养。根据缺氧时间不同将细胞分为常氧组（缺氧 0h），缺氧（0. 5、1、2、6、12、24h）组。将鼠尾胶原包被盖玻片的 24 孔板分为常氧组（正常培养箱中培养 6h）和缺氧 6h 组。
3 检测指标与方法
3. 1 肠上皮细胞 Beclin1、P62 和 LC3 蛋白表达的检测 采用蛋白质免疫印迹法[7]检测，以β-actin 作内参，方法简述如下： 用4℃磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗细胞后即加入细胞裂解液放置冰上低温裂解细胞，收集样本于 1. 5mL 尖底离心并用细胞超声破碎仪破碎，离心（12 000r/min、10min、4℃），取上清液煮沸 5min,行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳并转移至 PVDF 膜。用 5% 脱脂奶粉室温封闭 1h,然后分别加入兔抗 Beclin1 抗体、兔抗 P62 抗体、兔抗 LC3 抗体及鼠抗 β-actin 抗体，4℃孵育过夜。次日以吐温-20-三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液（TBST）洗膜 4 次后分别加入二抗 HRP-羊抗兔IgG 和 HRP-羊抗鼠 IgG,室温孵育 1h.再次用 TBST洗膜 4 次后加入化学发光液，用凝胶图像分析系统采集发光信号。Quantity One 软件对蛋白表达行相对定量分析，Beclin1 及 P62 蛋白表达量分别以 Bec-lin1 或 P62 与 LC3 Ⅰ蛋白的比值表示，LC3 蛋白表达量以 LC3Ⅱ与 LC3Ⅰ的比值表示。
3. 2 透射电镜检测自噬 用细胞刮常规收集 6 孔板贴壁细胞，置于尖底离心管离心（1 000r/min、8min） ,吸去上清液，加入 2. 5% 戊二醛固定液固定细胞团，4℃固定 2h 后用 PBS 漂洗 3 次，15min/次。再于 1% 锇酸固定液固定 2h 后用 PBS 漂洗 3 次，15min /次。乙醇梯度脱水后用环氧树脂和丙酮等体积混合渗透过夜，聚合器中聚合，环氧树脂 618 包埋，半薄切片定位、超薄切片，醋酸双氧铀 - 柠檬酸铅双重染色，置于 H-600 型透射电镜下观察并拍照。
3. 3 GFP-LC3B 融合蛋白示踪自噬体形成 扩增GFP-LC3B 融合蛋白表达载体质粒，抽提质粒 DNA并用紫外分光光度仪测定其浓度与纯度后备用。将细胞接种于 24 孔板中的盖玻片上，待其生长 24h后，严格按照 Lipofectamine 2000 质粒转染试剂盒（美国 Invitrogen 公司） 说明书的方法进行瞬时转染。转染 24h 后，将细胞分别置于常氧培养箱及缺氧培养箱培养，6h 后用 PBS 漂洗 5min,1% 多聚甲醛（PFA）固定 30min,PBS 漂洗 3 次（5min/次）后封片，激光共聚焦显微镜观察并拍照。
4 统计学分析
数据采用 SPSS17. 0 统计软件行统计学分析，以x珋 ± s（均数 ± 标准差）表示，多组间均数比较运用单因素方差分析，P <0. 05 有统计学意义，P <0. 01 有显着统计学意义。
结 果
1 缺氧后自噬相关蛋白 Beclin1、P62 和 LC3 蛋白表达的变化
如图 1、2、3 免疫印迹结果及表 1 定量分析结果所示，与正常对照（0h）相比较，缺氧后肠上皮细胞Beclin1 及 LC3 蛋白表达均呈逐渐增加趋势，且均在缺氧后 12h 蛋白表达达到峰值，至缺氧后 24h 蛋白表达虽有所回落，但仍显着高于正常对照。P62 蛋白表达在缺氧后进行性降低，至缺氧后 24h 降至最低。
2 缺氧后自噬溶酶体的变化
自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接观察自噬体需在透射电子显微镜下。因此，透射电镜观察是目前确认是否发生自噬的最重要形态学指标，被认为是检测是否发生自噬的金标准。笔者也利用透射电镜观察了缺氧对肠上皮细胞自噬溶酶体变化的影响。由于上述自噬相关蛋白 Beclin1、P62 及 LC3 蛋白表达均在缺氧后 6h 与正常对照有显着差异，因此我们观察了缺氧后 6h 肠上皮细胞自噬溶酶体的变化情况。图 4 的结果表明，与正常对照相比较，缺氧后肠上皮细胞内自噬溶酶体数目明显增多（图中箭头所示），表明缺氧后肠上皮细胞自噬增强。
3 缺氧后 GFP-LC3B 融合蛋白示踪的变化
GFP-LC3B 融合蛋白示踪技术的原理是利用LC3B 在自噬形成过程中发生聚集这一现象，无自噬时 GFP-LC3B 融合蛋白弥散地分布于胞浆内； 发生自噬时 GFP-LC3B 融合蛋白转位至自噬体膜聚集，在荧光显微镜下可观察到多个明亮的绿色荧光斑点。笔者采用 GFP-LC3B 融合蛋白示踪方法观察了缺氧后 6h 肠上皮细胞自噬的发生情况，图 5 的结果表明，正常对照的肠上皮细胞内分布较均匀一致的绿色荧光，而荧光斑点形成较少； 缺氧后 6h 的肠上皮细胞内绿色荧光斑点形成明显增多，表明缺氧后肠上皮细胞自噬明显增加。
讨 论
严重烧伤早期最主要的病理生理变化为大量体液渗出，有效循环血量锐减，使机体处于休克状态，导致全身组织缺血缺氧，故严重烧伤早期全身性损害的实质是组织器官的缺血缺氧性损害。有资料表明[8],肠系膜血管的血管紧张素受体密度比其他部位高，故对血管加压素敏感性高，休克时肠系膜血流量显着减少，而机体为了保证心脑等重要脏器的血流灌注，通过血流重分布方式“牺牲”肠道等相对不重要器官的血流以维持心脑等血流灌注，这就使得肠道等的血流灌注量更进一步降低，导致肠道黏膜缺血缺氧。既往的研究表明[9],严重烧伤早期缺血缺氧时肠黏膜组织结构损害、肠道屏障功能受损及通透性增加，引起肠腔内细菌及内毒素移位。但是，迄今为止，严重烧伤早期肠黏膜损害的机制仍不完全清楚。
近年来，自噬在组织缺血缺氧性损害中的作用已受到广泛关注。据国外文献报道[10 - 11],在缺氧时结肠癌 HT -29 细胞自噬相关蛋白 LC3 表达增加及P62 表达降低，表明缺氧后细胞自噬作用增强。在小鼠模拟急进高原实验研究发现[12],急进高原组小鼠肠道机械屏障受损伤且肠道上皮细胞内自噬相关蛋白 LC3 及 Beclin1 表达升高，但自噬作用的上调与肠道机械屏障损伤的关系目前尚不明确。笔者最近的研究也发现[13],在小鼠严重烧伤早期，重要脏器如心、肝、肺、肾组织的自噬标志分子 Beclin1 及LC3 蛋白表达升高，自噬溶酶体增多，表明严重烧伤可引起组织细胞自噬增加。肠道作为应激反应的中心器官，缺血缺氧时肠黏膜上皮细胞自噬是否也增加呢? 目前的研究资料尚不能明确回答这一问题。
为此，本实验利用体外缺氧模型，研究了缺氧条件下人肠上皮细胞自噬的动态变化。实验结果表明，肠上皮细胞在缺氧 0. 5h 后，自噬相关蛋白 Beclin1 和LC3 的蛋白表达水平均开始增加，且随着缺氧时间的延长而进一步增加，到缺氧 12h 达到峰值，至 24h虽有回落，但仍显着高于正常水平。与此相反，另一种自噬相关蛋白 P62 的蛋白表达则随着缺氧时间的延长逐渐降低，到缺氧 24h 时降至最低。过去的研究表明[14],自噬相关蛋白 Beclin1、LC3 及 P62 均在自噬的发生与发展中起着非常重要的作用，被认为是细胞自噬形成的标志性分子。Beclin1 蛋白与自噬过程中形成吞噬小泡的起始密切相关； LC3 定位在自噬体双层膜的整个延长阶段，且贯穿整个自噬过程； P62 在自噬过程中作为一种调节因子参与自噬，但在自噬晚期被逐渐降解。很显然，本实验观察到的缺氧后 Beclin1 与 LC3 蛋白表达增加及 P62 蛋白表达降低表明了缺氧状态下肠上皮细胞自噬增强。本实验的透射电镜结果也表明，缺氧后肠上皮细胞内自噬溶酶体数目增加； 进一步的 GFP-LC3B融合蛋白示踪结果更是表明，缺氧后肠上皮细胞内绿色荧光斑点形成明显增多，即自噬溶酶体增加，这些均与上述缺氧后肠上皮细胞 Beclin1、LC3 及 P62这三种自噬相关蛋白表达的变化趋势相吻合。因此，综合本实验的结果，笔者认为缺氧能引起肠上皮细胞自噬明显增强。
目前的研究认为，自噬在机体的各种生命活动中发挥着重要作用，适度的自噬可加速细胞新陈代谢及细胞器更新，参与缺血缺氧等饥饿状态下细胞适应性反应的调节，但过度的自噬则引起自噬性细胞死亡，导致组织损害[4 - 14].因此，自噬究竟是起保护性作用，还是损伤性作用，目前还存在较大的争议。近期有研究发现，特异性抑制严重烧伤早期缺血缺氧时心肌细胞的自噬，能明显减少心肌细胞过度死亡，减轻心功能损害，表明心肌细胞自噬增加参与了严重烧伤早期缺血缺氧时心肌组织功能损害的发生[15].过去的研究表明，缺氧可引起培养的人肠上皮细胞紧密连接相关蛋白发生改变，导致紧密连接屏障功能损害[16].本实验发现的缺氧能引起肠上皮细胞自噬水平明显增强，是否与缺氧后肠上皮细胞紧密连接相关蛋白改变及屏障功能损害有关，目前尚难以明确，笔者将对此进行深入研究。
