尽管各种治疗手段的改进,缺血性心脏病仍是目前全球致死性疾病的首要病因。缺血预处理(IPC)被公认为有效的心肌保护方式,但IPC必须在缺血前应用,因此临床应用受到限制。研究人员发现缺血后处理可以通过减小缺血心肌梗死面积,提高血管内皮细胞功能等途径发挥心肌保护功能。
而且缺血后处理不受时间的限制,已有研究人员证实缺血后处理可以在经皮冠状 动 脉 介 入 术 中 使用。然而缺血后处理的分子机制仍然不清楚。
目前多数研究使用乳鼠心肌细胞或者新生鼠心肌细胞缺氧复氧模型。新生鼠心肌细胞与成年鼠心肌细胞在形态、结构和功能上存在很大差异,很难将新生期心肌细胞培养所得的研究结论应用到完全分化的成熟心肌细胞中。且成年心肌细胞更有科学研究价值。故本实验采用成年大鼠心肌细胞缺氧复氧模型探讨缺氧后处理的心肌保护机制。
1 材料与方法
1.1 动物SD大鼠,雄性,体质量250~350g,由重庆第三军医大学实验动物中心提供[SCXK(渝)2012-0005]。
1.2 主要药品、试剂及仪器硫氢化钠(Sigma,美国);M199培 养 基 (Thermo,美 国);层 粘 连 蛋 白(Sigma,美国);Ⅱ型胶原酶(Sigma,美国);磷酸化p38MAPK一 抗、b-actin以 及 相 应 的 二 抗 (SantaCruz,美国);线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(碧云天生物技术研究所,江苏);ALC-HP型离体心脏灌流实验装置(奥尔科特生物科技有限公司,中国);DIG-303A型艾柯超纯水器 (成都唐氏康宁科技发展有限公司,中国);激光共聚焦显微镜 (Leica,德国);95%O2+5%CO2细胞培养箱 (Thermo,美国);95%N2+5%CO2细 胞 培 养 箱 (Thermo,美国);Petri皿 (杭州生友生物技术有限公司,中国);其他试剂均为国产分析纯。
1.3 心肌细胞的分离培养腹腔注射异戊巴比妥40mg/kg,肝素250μg/kg麻醉后迅速剑突下剖胸取出心脏,应用langendorff离体灌注装置,依次逆行灌注750μm Ca2+液,无Ca2+EGTA液,Ⅱ型胶原酶液;之后将消化好的心脏浸泡于5mL含1%的Ⅱ型胶原酶液中,并置于37℃恒温水浴摇床上震荡5min/次,160μm无菌滤网过滤收集酶液于无菌试管内,置于37 ℃恒温水槽内等待心肌细胞自然沉降,重复操作5次;酶洗脱洗涤沉降细胞3~4次,M199培养基洗涤细胞2次,收集细胞;将细胞数以104/cm2的密度平铺于层粘连蛋白预处理的Petri皿中,加入培养基放入95%O2+5%CO2细胞培养箱。
1.4 实验分组将每次分离培养的细胞随机分为3组:正常组(NOR)、缺氧复氧组(H/R)、缺氧后处理组(HP)。NOR组细胞持续在95%O2+5%CO2细胞培养箱中培养6h;H/R组正常培养4h后换上缺氧培养基(临用前99.9%高纯氮气饱和1h,并测血气氧分压<60mmHg)置于缺氧培养箱中1h后,再次正常培养1h;HP组于再次正常培养前进行复氧3min/缺氧3min,重复3次;余操作与H/R组相同。
1.5 检测指标
1.5.1 心肌细胞线粒体膜电位检测分组处理结束后,吸除培养基,加入1mL的细胞培养液及1mLJC-1染色工作液,孵育20min,激光共聚焦显微镜下观察。检测JC-1单体时激发光为490nm,发射光为530nm,产生绿色荧光;检测JC-1聚合物时,把激发光设置为525nm,发射光为590nm,产生红色荧光。红绿荧光的比值为线粒体膜电位的高低。
由不知分组情况的实验人员随机选择8个不同视野观察30个细胞。
1.5.2 Western blot检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)表达量各组加入去污裂解液裂解细胞,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,取50g总蛋白,加等量缓冲液,将电泳分离后的蛋白电转至PDVF膜 上,经 封 闭、洗 脱 后 加 入 磷 酸 化p-p38MAPK一抗,孵育过夜,加入相应的荧光二抗,避光孵育1h,扫描PDVF膜。分析软件检测各组p-p38MAPK条带积分光密度值与β-actin条带积分光密度值,两者的比值反映蛋白表达水平。
1.5.3 心肌细胞内钙离子浓度各组培养基加入2mL Flou-3AM(5μL/mol)负载30min。吸除培养基,用磷酸盐缓冲液洗涤3遍后,吸除液体,上镜检测。由不知分组情况的实验人员随机选择8个不同视野观察30个细胞内钙离子荧光强度。
1.6 统计学方法采用SPSS 17.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数标准差(x珚±s)表示。各组间采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 缺氧后处理对心肌细胞线粒体膜电位(MMP)的影响与正常组比较,H/R组和HP组MMP显着降低(P<0.05);HP组MMP明显高于H/R组(P>0.05),见图1,见表1。
2.2 缺氧后处理对心肌细胞钙离子浓度的影响与正常组和HP组比较,H/R组钙离子浓度显着升高(P<0.01);HP组和正常组间差异无统计学意义(P>0.05),见图2,表1。
2.3 缺氧后处理对心肌细胞p-p38MAPK表达量的影响与正常组和HP组比较,H/R组p-p38MAPK表达量显着升高(P<0.05);HP组和正常组间表达量差异无统计学意义(P>0.05),见表1。【表1】
3 讨论
1994年Gottlieb等从形态学和生物化学方面证实,缺血再灌注心肌中存有凋亡细胞。目前认为细胞凋亡对于缺血再灌注损伤(IRI)具有十分重要的意义,是心肌IRI心肌细胞死亡的重要方式之一,细胞凋亡数目的多少决定了IRI的严重程度。
故抑制细胞凋亡是抗IRI的一个重要手段。
现已明确线粒体参与了细胞凋亡过程,起着主开关作用。
MMP对于维持线粒体的正常功能是必要的。研究表明几乎所有的诱导剂诱发不同类型的细胞凋亡过程中,均出现MMP下降,且发生于细胞形态学改变之前。因此MMP下降是细胞凋亡早期的标志,一旦MMP耗损,细胞就会进入不可逆凋亡过程。如抑制MMP下降,则可能阻抑细胞凋亡的发生。本实验结果提示缺氧复氧导致MMP下降,缺氧后处理可以减轻这种改变。说明缺氧后处理可以通过抑制细胞凋亡发挥细胞保护作用。
大量的研究证实机体组织在缺氧时都会出现细胞内钙超载,这与本实验结果相符。
Ca2+超载是细胞缺氧的结果,而钙超载参与了核酸内切酶、需钙蛋白酶、谷氨酰胺转移酶等得激活,是启动细胞凋亡的关键因素。因此细胞内钙超载又是引起缺氧组织细胞凋亡的重要原因。目前有学者认为Ca2+的浓度变化是导致缺氧组织细胞凋亡的最后通路。因此细胞内Ca2+稳态的维持对于细胞生命活动是至关重要的。本实验结果提示缺氧后处理通过维持细胞内Ca2+稳态发挥心肌保护作用。
缺氧使线粒体功能受损,三磷酸腺苷(ATP)生成减少,致使肌膜及肌浆网膜钙泵功能障碍,不能排出和摄取细胞浆中多过的钙,造成包浆钙超载。研究表明当细胞质内Ca2+浓度低于0.2μmol/L时,线粒体通透性转换孔处于失活状态,而当细胞内Ca2+浓度升高时,高浓度的Ca2+能够诱导线粒体通透性转换孔开放。因此线粒体损伤和细胞内钙超载互为因果关系,本实验结果提示缺氧后处理可以同时保护线粒体和抑制钙超载,阻断恶性循环,发挥细胞保护作用。
p38MAPK是MAPK家族重要成员之一,可调控细胞增殖、分化、凋亡等。在心脏,p38具有双向功能。研究人员发现把IR心肌暴露于含氧量高的环 境,心 肌 功 能 障 碍 和 梗 死 面 积 大 大 减 轻,p38MAPK大量磷酸化,提示p-p38MAPK的心肌保护作用。然而有学者认为黄芩素可以通过抑制线粒体凋亡途径和p38MAPK通路来发挥细胞保护作用。本实验结果提示缺氧复氧损伤导致心肌细胞内p-p38MAPK表达量增高,缺氧后处理抑制此种反应。这种结果的差异可能与p38MAPK的异构体以及不同的保护方式有关。p38α,β在心脏中表达丰富,而γ,δ不表达于心脏。p38α缺氧和缺血时表达量增高,p38β抑制自由基形成进而抑制细胞凋亡。此试验结果中缺氧后处理抑制p38表达升高是否与p38异构体不同表达量有关需要进一步实验证实。
综上所述,缺氧后处理可对缺氧/复氧心肌细胞产生保护作用,其机制可能与下调p-p38MAPK表达量,抑制线粒体膜电位下降以及钙超载进而抑制心肌细胞凋亡有关。
