肺纤维化是呼吸系统疾病发展至晚期的共同病理改变,造成肺功能不可逆的损伤,严重危害人类健康。目前研究认为,肺纤维化的基本病理过程包括早期弥漫性肺泡炎及后期大量间质细胞增生,发生基质胶原的进行性积聚以致逐渐取代正常的肺组织结构,严重影响肺的通气和换气功能。 在增生的细胞中,除肺泡上皮细胞和成肌细胞等外,成纤维细胞的增殖及活化并分泌基质胶原是纤维化形成的重要机制。 TGF-β1 被认为是诱导肺成纤维细胞活化的最重要的细胞因子,其作用的发挥与 β-catenin 途径高度相关。 本研究通过观察 β-catenin 蛋白敲除对TGF-β1 诱导的肺成纤维细胞的增殖及活性的影响,探讨 β-catenin 蛋白敲除抗肺纤维化作用的细胞机制,为肺纤维化的治疗提供新的思路。
1、 材料与方法
1.1 主要试剂及物品
大鼠肺成纤维细胞 (CCC-REPF-1),pcDNA3.0载体(Invitrogen),F-TrCP-Ecad 载体(郑国平教授惠赠 ),Lipofectamine2000 (Invitrogen),TGF-β1 (PeproTech),抗 E-cadherin,抗 α -SMA,抗 Fn( SantaCruz),FITC 标志的羊抗小鼠 IgG(武汉博士德生物工程有限公司),胎牛血清(中国杭州四季青),高糖 DMEM 培养基(GIBCO),TRIzol 总 RNA 提取试剂(武汉博士德生物工程有限公司),逆转录试剂盒(Promega),实时荧光定量试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司),α-SMA 引物、colⅠ引物、colⅢ引物、GAPDH 引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。
1.2 肺成纤维细胞培养、传代及分组
在体外培养的大鼠肺成纤维细胞(CCC-REPF-1),用含 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的高糖 DMEM 培养基培养于 5%的 CO2,37℃人工培养箱中,细胞呈贴壁生长,进行传代培养。细胞分组,分为正常细胞组、TGF-β1 刺激组、pcDNA3 转染组、F-TrCP-Ecad 转染组。
1.3 pcDNA3 及 F-TrCP-Ecad 转染 CCC-REPF-1细胞
提取及纯化重组质粒 DNA, 测 DNA 浓度备用。
取对数期细胞消化,调整细胞数为 2×105cells/L,接种12 孔板中,观察细胞生长至 80%~90%时,弃培液,换无血清无双抗培养基 800 μL,准备转染。100 μL 无双抗、胎牛血清的培养基中加入 4 ng 质粒,混合后置5 min, 共 6 个 EP 管,3 管为质粒 pcDNA3,3 管为质粒 F-TrCP-Ecad,100 μL 无双抗、胎牛血清的培养基中加入 4 μL Lipofectamine2000 混合后置 5 min,6 个EP 管 ,将上述复合物混合后置 20 min,弃 12 孔 板 6孔的培养基,用无双抗、胎牛血清的培养基清洗 2 次,加无双抗、胎牛血清的培养基 800 μL,将上述复合物分别加入 6 个孔,前后晃置 4~6 h 换正常培养基。 转染 6 h 换新鲜培养基,各组分别加入 TGF-β1(5 ng/mL),作用 48 h。
1.4 CCK-8 法检测肺成纤维细胞增殖
将各组细胞调整细胞浓度至 5000 个/100 μL,以每孔 100 μL 接种于 96 孔板,每组复设 8 孔,每板每孔加入 CCK-8 10 μL,5%CO2孵育箱内继续孵育 1h,分光光度计下测定 450 nm 波长处 OD 值。
1.5 Western 印迹检测细胞中 E-cadherin、α-SMA、Fn的表达
取细胞用 PBS 洗涤后转移到 EP 管,离心后弃上清,将收集到的细胞加细胞裂解液裂解 1 h 后,离心30 min,取上清,BCA 蛋白质定量法测定蛋白浓度,取等量蛋白 30 μL 行 SDS-PVDF 凝胶电泳, 转膜至PVDF 膜,条件 4 ℃ 2~5 h,5%脱脂牛奶封闭 2 h。 在4 ℃下小鼠抗大鼠 E 钙黏蛋白、α-SMA、 纤维连接蛋白单克隆抗体(稀释为 1∶200)与膜接触孵育过夜,用洗膜缓冲液(TBST)在脱色摇床下洗膜 5 min×5 次,加羊抗小鼠 IgG, 室温下孵育 2 h 后,TBST 洗膜, 加入ECL 在 室温下反应 5 min 后 成像 ,Taiphone 扫 描结果,采用 Gene Snap/Gene Tool 软件分析以 GAPDH 蛋白为内参定量分析 E 钙黏蛋白、α-SMA、纤维连接蛋白条带相对灰度值。
1.6 总 RNA 抽提及实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real-timePCR)
各组细胞每孔加入 500 μL TRIzol Reagent,按试剂盒说明提取总 RNA 及行 RT-PCR 检测 α-SMA、colⅠ、col Ⅲ表达,GAPDH 为内参。
GAPDH 引 物序列 : 上游引物 5 ˊ - GGTGCT-GAGTATGTCGTGGAGT -3 ˊ 下 游 引 物 5 ˊ -CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT -3,α -SMA 上 游引物 5ˊ- AGCCAGTCGCCATCAGGAAC -3ˊ下游引物5ˊ- GGGAGCATCATCCCAGCAA-3ˊ,colⅠ: 上游引物 5ˊ- GACATGTTCAGCTTTGTGTACCTC -3ˊ下游引物 5ˊ- GGGACCCTTAGGCCATTGTGA -3ˊcolⅢ:上游引物 5ˊ- TTTGGCACAGCAGTCCAATGTA -3ˊ下游引物 5ˊ-GACAGATCCCGAGTTCGCAGA -3ˊ。PCR 反 应体系条件 : 95℃ 20 s;95℃ 3 s,60℃ 30 s。
40 个循环。 由随机附带软件计算出 Ct 值和拷贝数。
1.7 统计学方法
计量资料采用均数±标准差表示, 数据处理采用SPSS 19.0 软件进行 t 检验或方差分析,P <0.05 为差异有统计学意义。
2、 结果
2.1 肺成纤维细胞光镜下观察
成纤维细胞呈梭型,有较长的突起,胞核呈卵圆形,位于细胞中央,成放射状和栅栏状排列。 TGF-β1刺激后,细胞体积明显增大,胞突消失,细胞数量明显增多,细胞间隙变小。F-TrCP-Ecad 转染组大部分细胞呈梭型,有较长的突起,细胞间有明显间隙。
2.2 CCK-8 法观察各组肺成纤维细胞增殖与正常组比较, TGF-β1 刺激组、pcDNA3 转染组其 OD 值明显增高,但两组比较,无统计学差异;F-TrCP-Ecad 转染组 OD 值较 TGF-β1 刺激组明显减低(P<0.01),与正常组比较无统计学差异。 见表 1。
2.3 Western 印迹法检测各组细胞中 α-SMA、Fn、E-cadherin 的表达
与正常组比较, TGF-β1 刺激组、pcDNA3 转染组其 α -SMA、Fn 蛋白表达显著升高, E-cadherin 表达显著降低 (P<0.01), 而两组比较无统计学差异;F-TrCP-Ecad 转染组较 TGF-β1 刺 激组 α -SMA、Fn 蛋白表达显著降低,E-cadherin 表达显著升高(P<0.01),与正常组比较无统计学差异。 见表 2。
2.4 荧光实时定量 RT-PCR 检测 α-SMA、colⅠ、colⅢ表达
与正常组比较, TGF-β1 刺激组、pcDNA3 转染组β-catenin 途径 α -SMA,colⅠ,colⅢmRNA 表达增高(P<0.01), 而两组比较无统计学差异 ,F-TrCP-Ecad转染组较 TGF-β1 刺激组 α-SMA、colⅠ、colⅢ表达降低(P<0.01),与正常组比较无统计学差异。 见表 3。
3、 讨论
肺成纤维细胞增殖与活性增强是肺纤维化发生的重要的致病过程,对其机制的研究并寻找新的治疗靶点是目前研究的焦点。肺纤维化过程中在 TGF-β1刺激下使肺成纤维细胞不断地增殖和转型为肌成纤维细胞 (myofibroblast,MB)。 MB 是一种特殊阶段的FB,能够大量分泌 ECM,分泌能力是 FB 的 4~5倍 ,大量表达 α-SMA、Fn、I、III 型胶原,加速纤维化进程。
TGF-β1 是诱导肺成纤维细胞活化发生的最重要的生长因子,TGF-β1 发 挥作用的途径包括 Smad、β-catenin 和非 Smad 通路, 其 β-catenin 途径与疾病及纤维化形成的病理过程高度相关。 Vuga,et al发现 WNT5A 基因途径在 IPF 的肺成纤维细胞较正常肺成纤维细胞有显著地调节意义, 通过非经典的WNT / β-catenin 途 径WNT5A 激 活显著地诱导肺成纤维细胞增殖同时抑制细胞凋亡。 Chilosi 等报道了在特发性肺纤维化(IPF)患者受损支气管基底细胞和损伤部位肺成纤维细胞中可见 β-catenin 向细胞核内转移、积聚,提示 β-catenin 与肺纤维化及肺成纤维细胞活性的相关性,因此我们设想通过抑制 β-catenin功能可能对肺纤维化发挥治疗作用。
F-TrCP-Ecad 质粒是 Cong等设计的 β-catenin靶向降解质粒,只降解细胞质中的 β-catenin 蛋白,而不破坏细胞膜上的 β-catenin 蛋白, 从而减少其向细胞核内的转移,降低其转录活性。 本研究采用该载体转染大鼠成纤维细胞, 观察阻断 β-catenin 途径对肺成纤维细胞增殖及活性的影响。 结果显示:TGF-β1刺激 48 h 后,成纤维细胞体积明显增大,胞突消失,细胞数量明显增多, 细胞间隙变小,F-TrCP-Ecad 转染组大部分细胞呈梭型,有较长的突起,细胞间有明显间隙。 CCK-8 法检测 F-TrCP-Ecad 转染组肺成纤维细胞增殖较 TGF-β1 刺激组明显降低。 F-TrCP-Ecad 转染组肺成纤维细胞间质细胞标志物 α -SMA、Fn 蛋白表达量明显低于 TGF-β1 刺激组,E-cadherin表达量较 TGF-β1 刺激组增高。 F-TrCP-Ecad 转染组大鼠肺成纤维细胞 β-catenin 途径转录产物 α-SMA、colⅠ、colⅢ表达明显降低, 证实 β-catenin 蛋白敲除通过降解细胞质中的 β-catenin 蛋白, 减少其向细胞核内的转移抑制 TGF-β1 诱导的肺成纤维细胞增殖、活性增强,抑制纤维化进程。
综上所述,TGF-β1 是促进肺成纤维细胞增殖、活化的重要细胞因子,β-catenin 途径是 TGF-β1 发挥作用的重要信号通路,β-catenin 蛋白敲除载体(F-TrCP-Ecad 质粒)通过阻断该信号途径 ,阻断成纤维细胞转化为其活性形式肌成纤维细胞,同时抑制成纤维细胞释放胞外基质,阻断纤维化进程,从而能为肺纤维化疾病治疗提供新的思路及实验依据。
