神经病理性疼痛(neuropathy pain,NPP)是由于感染、肿瘤和外伤等原因导致中枢或外周神经系[1,2]统损伤后所引起的一种慢性疼痛状态 .由于其发病机制极其复杂,而且镇痛药物的治疗效果较差,因此,NPP已经成为严重影响患者生存质量的临床顽症之一,而研制更为有效的治疗手段也成为学者[3]们的研究热点 .近年来的研究发现,微量元素锌似[4]乎与NPP密切相关 .因此,为了深入研究锌对NPP的影响,本文将c-fos蛋白和动物行为学作为观察对象,利用原子吸收光谱技术、动物行为学检测、免疫组化和图像分析技术检测锌预处理对c-fos表达和动物行为学的影响,从而为揭示锌影响NPP的机制提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
兔抗小鼠多克隆c-fos抗体(cellsignaling公司);免疫组织化学染色试剂盒和DAB染色剂(福州迈新公司);辣椒素(Santa公司);光学显微镜、原子吸收光谱仪、von Frey刺激针和计算机图像分析系统等.
1.2 动物分组与模型制备
48只C57/BL6小鼠,8周龄大,雌雄各24只,体重20~30g(北京维通利华实验动物中心提供).将小鼠随机分4组:采用右后足底注射辣椒素(0.5%,5μl)制备NPP模型.①对照组(Con):给予适锌饲料(锌30mg/kg/d)喂养2周后,右侧后足底注射溶剂(吐温80、酒精和生理盐水混合液);②适锌喂养组(N-NPP):给予适锌饲料(锌30mg/kg/d)喂养2周后足底注射辣椒素;③低锌喂养组(L-NPP):给予低锌饲料(锌0.85mg/kg/d)喂养2周后注射辣椒素;④高锌喂养组(H-NPP)给予硫酸锌水溶液(227mg/L/d)喂养2周后注射辣椒素.
1.3 取材与标本制备、动物自主行为学观察
注射辣椒素后第7天,将小鼠用4%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉后,取腰5节段的脊髓,一部分称重后,-80℃保存,用于原子吸收光谱技术检测;另一部分放入4%多聚甲醛溶液固定12h,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,制备5μm厚的石蜡切片,用于免疫组织化学染色.
从注射辣椒素前2天开始,每天观察小鼠的行为学变化,观察有无跛行、注射侧后足不敢着地负重、舔足、咬足、足部畸形、自噬、离地时间延长等现象,一直观察到注射辣椒素后第7天.
1.4 机械痛阈检测、原子吸收光谱技术
注射辣椒素前2天和注射后第7天,将小鼠放在围有透明玻璃的金属网眼平台上,等动物适应环境后,用von Frey刺激动物右后足底.动物出现缩足和快速甩足等动作时认为是有反应;刺激针弯成90度而动物没有抬足等反应则认为是无反应.10次当中出现5次以上的缩足反应者视作阳性,机械性痛阈[5](g)就是能引起缩足反应的最小力度 .足底注射辣椒素后第7天,取血清和脊髓组织.血清加入三氯醋酸,3000r/min离心5min,取上清;脊髓组织经混合酸浸泡过夜后消化,利用原子吸收光谱分析法测定锌含量.
1.5 免疫组织化学染色、图像分析
石蜡切片常规脱蜡入水,用微波进行修复.经3%H O 孵育10min,以封闭内源性过氧化物酶;0.01M2 2PBS冲洗,5min×3次;用正常非免疫动物血清孵育10min;甩掉血清,加入兔抗小鼠多克隆c-fos抗体(1: 200),在4℃下孵育过夜;0.01M PBS冲洗,5min×3次;加入山羊抗兔IgG(1: 200),室温下孵育10min;0.01M PBS冲洗,5min×3次;加入链霉素抗生物素-过氧化物酶孵育10min;0.01M PBS冲洗,5min×3次;用DAB显色5min,入水中止反应.切片常规脱水、透明和封片,光镜下进行观察.用正常非免疫动物血清代替一抗作为阴性对照.
用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对免疫组化结果进行图像分析.每个样本选取5张切片,每张切片于400倍光镜下系统随机选取3个视野进行检测,计算平均光密度值(average optical,AO).
统计学分析应用SPSS19.0软件进行统计处理,实验数据用均数±标准差
表示,采用单因素方差分析(ANOVA)方法进行数据分析, P<0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 原子吸收光谱检测结果
在注射辣椒素后7d,正常喂养组动物血清锌和脊髓中的锌含量均显着减少( P<0.01).低锌喂养组动物血清锌和脊髓锌的含量更低;而高锌喂养组动物的血清锌和脊髓锌含量最高P <0.01,图1 2).
2.2 小鼠行为学变化
足底注射辣椒素后第1天小鼠即出现注射侧后足跛行、不敢负重、经常将后足缩至腹部或拖着后足行走,伤侧脚趾外翻并拢,经常舔足或甩足,活动度减少,明显不如注射之前活跃,这种行为一直持续到观察期末.其中,低锌喂养组(L-NPP)小鼠行为学改变最为严重,而高锌喂养组(H-NPP)小鼠的行为学改变最轻.机械痛阈检测显示:各组动物注射辣椒素后7天的机械痛阈显着降低,痛敏增强( P<0.01).其中,L-NPP组的机械痛阈最低,而H-NPP组的痛阈最高( P<0.01,图3).
2.3 免疫组化染色结果
c-fos免疫组织化学阳性产物呈棕褐色颗粒状,主要表达在脊髓神经元的细胞核上.对照组动物在脊髓后角浅层有少量的阳性表达产物,阳性细胞较少.与对照组相比,其它三组NPP动物的c-fos阳性表达均增多,阳性细胞密集,平均光密度(AO)值增高( P<0.01).其中,L-NPP组的阳性颗粒和阳性细胞最密集,AO值最高;H-NPP组的阳性颗粒和阳性细胞最稀疏,AO值最低( P<0.01,图4,5).
3 讨论
神经病理性疼痛是由神经系统受损伤所引发的一种慢性疾病,其发病原因多样, 包括:糖尿病等代谢系统疾病所引发的神经痛、肿瘤侵袭等引发的神经痛、脑和脊髓外伤等引起的中枢神经系统损伤、[6-7]病毒感染和放化疗所引发的神经痛并发症等 .患者的主要临床病理生理学表现是:痛觉过敏、痛觉超敏、自发性疼痛和异位痛等.近年来,由于社会老龄化日益严重,而且癌症等疾病的生存率逐年提[8]高,导致NPP的发病率显着增加, 高达1%左右 .由于这种疼痛剧烈而持久,可持续数周、数月甚至数年,临床上缺乏有效的治疗方法,药物治疗往往还伴随着成瘾性等问题,因此,NPP已经成为学者们密切关注的一大顽症,而深入探讨NPP的发病机制,寻找有效的治疗靶点势在必行.
研究发现,锌是机体的一种重要的微量元素,[9]其广泛分布于机体的各种组织和器官 ,在中枢和外周神经系统中的分布尤其丰富,其中,游离状态的[10]锌在神经传导活动中发挥着极其重要的调控作用 .[4]Nozaki等 发现,锌是病理性疼痛的一种内源性的抑制剂,能抑制在兴奋性传导过程中起重要作用的NMDA受体,其与病理性疼痛的形成与传导密切相[11]关.有报道称 ,神经损伤后,脊髓后角浅层的锌离子显着减少,伴随动物的机械性痛阈降低,动物出现痛觉过敏现象,提示锌可能参与了痛觉的产生与传导.另有研究发现,锌能抑制对NPP的产生具[12]有促进作用的P物质在脊髓的表达 ;此外,锌也能使痛阈升高,降低痛敏,提示锌可能对病理性疼痛[13]具有抑制作用 .本研究结果与之前的研究相符,我们利用原子吸收光谱技术和动物行为学观察发现,NPP后,动物血清和脊髓中的锌含量显着减少,动物的机械痛阈降低,痛敏增强.高锌喂养能改善血清和脊髓中的缺锌状态,提高机械痛阈值,减轻痛敏;而低锌喂养则加重血清和脊髓中的缺锌状态,降低机械痛阈值,促进痛觉过敏,提示,锌对病理性疼痛具有抑制作用.
那么锌是如何抑制病理性疼痛的呢?研究发现,原癌基因c-fos作为一种即刻早期基因,它能被第二信使诱导,参与细胞内信息传递过程,在NPP时的表达显着增多,是神经元激活的标志,也[14]是痛觉过敏状态发展的反映 .研究发现,在甲醛引起的炎性痛模型中,c-fos蛋白在脊髓表达上调,[15]热痛阈降低 ;鞘内给予c-fos反义寡核苷酸探针能显着抑制福尔马林和腰5脊神经结扎诱导的大鼠腰髓背角c-fos阳性神经元的增加,提示c-fos的活化对于病理性疼痛的发展有显着意义,而抑制其活化能缓[16]解慢性疼痛 .本研究中,我们发现,对照组动物在脊髓后角浅层c-fos只有少量阳性表达,阳性细胞较少.注射辣椒素后,脊髓后角c-fos阳性表达显着增多,阳性细胞密集,AO值增高.高锌喂养能使c-fos的表达显着下调,AO值降低;而低锌喂养能使c-fos的表达更多,AO值增高,我们推测锌可能通过降低脊髓后角原癌基因c-fos的表达从而抑制了病理性疼痛的产生与传导,进而使动物的机械痛阈显着增高,痛敏降低.尽管我们的研究结果为研究锌参与NPP的机制提供了一定的理论数据,但是,锌是通过怎样的机制来抑制c-fos的表达?锌是否还通过其它的机制参与NPP的传导?这些都有待于我们更深入的研究.
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