全球有 3． 5 亿人感染乙肝病毒( hepatitis B virus，HBV) ，感染 HBV 是肝脏疾病的主要原因，HBV是肝细胞癌( hepatocellular carcinoma，HCC) 的致病因子已得到公认。肿瘤的扩散、转移是恶性肿瘤的主要特征，肝癌细胞的连续增殖和不断分化是肝癌转移浸润的重要原因之一。基质金属蛋白酶( matrixmetalloproteinases，MMP) 是一种依赖锌离子的蛋白酶家族，在肿瘤的转移浸润过程中参与细胞外基质的降解。其中 MMP-2 与肝癌的发生发展、转移浸润密切相关。HepG2． 2． 15 细胞是含有 HBV 基因的肝癌细胞，是研究 HBV 的细胞模型系统。HBx基 因是HBV病毒基因组中最小的开放性读码框，HBx 蛋白是一种多功能蛋白，参与细胞周期与凋亡调控、信号转导通路、DNA 复制、细胞黏附和肝癌发生等病理过程。有研究显示肝细胞在表达 HBx 后MMP 的表达也会发生改变，具体机制还有待进一步研究。本实验应用 ＲNA 干扰技术沉默 HBx 基因，观察抑制 HBx 基因表达对 HepG2． 2． 15 细胞增殖及MMP-2 表达的影响，初步探讨 HBx 基因与肝癌转移浸润的相关性。
1 材料和方法
1． 1 材料 肝癌细胞株 HepG2． 2． 15 购自博慧斯生物技术公司; psiHBV/X 与对照质粒 pTZU + 1 由泸州医学院张建军教授惠赠; 质粒扩增菌种 DH5α、内切酶等购于宝生物有限公司; DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶为 Gibco 产品; 胎牛血清购于HyClone 公司; LipofectamineTM2000 为 Invitation 公司产品; MMP-2抗体购自 Santa Cruz 公司; PCＲ 引物由 TakaＲa 公司合成。
1． 2 方法
1． 2． 1 实验分组及质粒转染 实验分四组: 以未转染的细胞作为空白对照组( control group) ; 仅加脂质体的细胞作为脂质体组( LipofectamineTM2000 group) ; 以转染阴性对照质粒细胞作为质粒对照组( control plasmid group) ; 以转染 psiHBV/X 质粒细胞作为 psiHBV/X 实验组( psiHBV/X group) 。利用脂质体 LipofectamineTM2000 将 pTZU + 1 与 psiHBV / X 质粒转入细胞( 操作步骤同说明书) : 选取对数生长期细胞，待细胞汇合度为70%左右时进行转染，6 h 后更换正常培养基，继续培养24、48、72 h。
1． 2． 2 ＲT-PCＲ 检测 HBx 基因的表达 ＲT-PCＲ 分析转染24 h后各组细胞 HBx 基因的表达情况，HBx 引物为: 上游5'-TCATCGCCAGCATCATCAAAC-3'，下游 3'-ATGTACGGCTG-GAGGTCTGTCA-5'，扩增长度为 463 bp。用 ＲNA 抽提试剂盒分别提取每组细胞总 ＲNA，按试剂盒说明书进行反转录反应，以 2 μL ＲT 产物为模板，分别扩增 β-actin 和 HBx 基因片段。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统扫描，以各组目的基因与内参的吸光度比值作为相对表达量，比较各组之间的差异。
1． 2． 3 MTT 法检测细胞的增殖 取对数生长期细胞接种于96 孔板中，1 × 104/ 孔。按实验分组进行细胞转染，置于 CO2培养箱中培养 24、48、72 h，洗掉培养液，加入不含胎牛血清的培养基 100 μL、50 μL MTT 溶液，继续培养 4 h，吸掉各孔上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，摇床低速震荡10 min，预热酶联免疫检测仪 20 min 后，酶标仪 490 nm 波长处测定各孔吸光度值，计算转染24、48、72 h 细胞增殖情况。
1． 2． 4 Ｒeal-time quantitative PCＲ ( qＲT-PCＲ ) 检 测 MMP-2mＲNA 表达 细胞总 ＲNA 提取同上。取 ＲNA 样品 2 μL，用98 μL DEPC 处理过的双蒸水混合于石英比色杯中，以 DEPC 处理过的双蒸水为空白对照管，在紫外分光光度计上分别测定其260 nm 和 280 nm 处的吸光度( A) 值。1． 70≤A260/ A280≤2． 2 认为纯度符合要求。将 ＲNA 样品用以 DEPC 处理过的双蒸水稀释为50 ng / μL。上反转录仪，反转录条件为: 37℃ 15 min，85℃ 5 s。取出 cDNA 后进行后续实验。MMP-2 引物: 上游 5'-CTCATCG-CAGATGCCTGGAA-3'，下游 3'-CAGCCTAGCCAGTCGGATTTG-5'，扩增长度为 167 bp。内参 β-actin 引物: 上游 5'-TGGCACCCAG-CACAATGAA-3'，下游 3'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5'，扩增片段长度232 bp。采用2－ △△Ct法计算 MMP-2 mＲNA 的相对表达量。
1． 2． 5 Western blot 法检测 MMP-2 蛋白表达 用预冷 PBS 将各组细胞漂洗 2 次，加入 1 mL 蛋白裂解液充分裂解，4℃，12 000 r / min离心 5 min，上清即为蛋白提取物。按 BCA 蛋白含量检测试剂盒步骤制作标准曲线，计算样品蛋白浓度。取30 μg蛋白样品与上样缓冲液混匀，行SDS-PAGE，80 V 约4 h。电泳完后取下凝胶，电转至PVDF 膜，用50 g/L 的脱脂奶粉室温摇床封闭1 h。兔抗人 MMP-2 抗体 MMP-2 一抗( 1∶500) 37℃孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次。加 HＲP 标记的山羊抗兔二抗 37℃ 孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次，ECL 发光显色。用 Quantity One 定量分析软件分析吸光度比值。
1． 2． 6 统计学分析 实验结果用 x ± s 或 百分比表示，用SPSS18． 0 统计软件包进行分析，多组定量资料比较用方差分析，组间比较用 t 检验。实验结果以 P ＜0．05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 质粒 psiHBV/X 酶切、测序 psiHBV /X 为氨苄抗性质粒，经转化 DH5α 后，对从阳性菌落中扩增提取的质粒 psiHBV/X 进行酶切，psIHBV/X 表达载体未被酶切和经 SalⅠ酶切后，大小基本相等，经 Hind Ⅲ和EcoＲⅠ双酶切后重组体质粒产生 2 800 bp、395 bp 左右的2 个条带，经 Xba Ⅰ酶切成约 3 100 bp 的 DNA 片段，证实重组表达质粒 psIHBV/X 构建正确( 图 1) 。
将质粒送到生工测序，引物为 U6 启动子的通用引物，测序结果显示 shＲNA 的表达模板 5'-TCGAG-GAACCAACAAGAAGATGAG TTCGCTCATCTTCTTGT-TGGTTCTTTTT-3'成功插入了载体中。证实特异表达载体 psiHBV/X 构建正确。psiHBV/X 质粒插入测序结果( 下划线为小干扰 ＲNA 的作用靶点) : GCTT-TATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCGA G-GAACCAACAAGAAGATGAGTTCGCTCATCTTCTTGT-TGGTTCTTTTTCTAGAGCGGACTTCGGT。
2． 2 ＲT-PCＲ 检测 HepG2． 2． 15 细胞 HBx 基因的表达 ＲT-PCＲ 检测结果显示 psiHBV/X 组 HBx 表达量低于其它各组，差异有统计学意义( P ＜ 0． 01，图 2、表 1) ，抑制率为 53． 60%。而其他各组表达量差异无统计学意义( P ＞0． 05) 。
2． 3 psiHBV /X 转染抑制细胞的增殖 MTT 法结果显示: 空白组24、48、72 h A490的吸收值分别为0．44 ±0． 03、0． 73 ± 0． 02、1． 11 ± 0． 05，而 psiHBV / X 组 24、48、72 h A490的吸收值分别为0．39 ±0．09、0．62 ±0．02、0． 99 ± 0． 04。说明 psiHBV / X 组在转染后 24、48、72 h都对细胞生长具有抑制作用，与对照组相比差异有统计学意义( P ＜0．05，图3) 。
2． 4 psiHBV /X 转染抑制细胞 MMP-2 mＲNA 表达标准曲线线性良好，具有可重复性，证明 ＲNA 有较好的扩增能力。由融解曲线图可知各实验组曲线峰值单一，主峰位置基本一致，无杂峰，说明产物均一。实验结果使用2－ △△Ct法进行分析，结果显示: 空白对照组、脂质体组、质粒对照组表达无显着差异( P ＞0． 05，表 2) ，干扰 24 h 实验组和 48 h 实验组MMP-2 mＲNA 的表达较其它组明显下调( P ＜ 0． 01) 。
2． 5 psiHBV /X 转染抑制 MMP-2 蛋白表达 转染24、48 h 后收集各组细胞，提取总蛋白，Western blot法检测转染后各组细胞 MMP-2 蛋白表达变化。结果所示: 空白对照组、脂质体组、空载体组比较，表达无显着差异( P ＞0． 05) ，干扰 24 h 实验组和 48 h 实验组 MMP-2 蛋白表达下降，与对照组比较差异具有统计学意义( P ＜0． 05，图 4，表 3) 。
3 讨论
全球有 3． 5 亿人感染 HBV，HBV 是肝细胞癌( HCC) 的致病因子已得到公认。HBx 基因是 HBV病毒基因组中最小的开放性读码框，是 HBV 复制的关键基因。HBx 蛋白是一种多功能蛋白，与甲基转移酶 PＲMT1 结合可调节乙肝病毒的转录，并参与细胞周期与凋亡调控、信号转导通路、DNA 复制、细胞黏附和肝癌发生等病理过程，HBx 蛋白可干扰先天免疫的 ＲIG-I 通路从而影响病毒的复制。HBx蛋白在肝癌的发生发展中起重要作用。HBx 基因转染可加快肝癌细胞周期的进程，促进肝癌细胞生长，使肝癌细胞恶性程度增高。也有研究显示 HBx 可通过上调 HIF-1 的表达，从而促进肿瘤血管生成及转移。因此，HBx 可作为阻断 HBV 感染相关性肝癌发生发展的靶基因。
MMP 能降解 ECM 中的蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。目前 MMP 家族已分离鉴别出26 个成员，其中 MMP-2 基因位于人类染色体 16q21，由 13 个外显子和 12 个内含子所组成。研究发现，MMP-2 与肝癌、宫颈癌、胶质瘤等多种肿瘤的浸润侵袭有关。另有研究报道丙型肝炎病毒的感染与 MMP-2 的激活有关。但 HBx在肝癌转移浸润中所起的具体作用还需深入研究。
为进一步探索 HBV 感染与肝癌转移浸润的关系及其作用机制，本研究用 HBx 干扰载体 psiHBV/X转染 HepG2． 2． 15 细胞，观察 HBx 基因沉默后细胞增殖情况及对 MMP-2 表达的影响。实验结果显示:
siＲNA 表达载体对 HepG2． 2． 15 细胞增殖有明显抑制作用，抑制率明显高于空白对照组、空载体组、脂质体组。同时，空白对照组、空载体组、脂质体组之间的差异无显着性。结果显示在转染后 48 h 抑制效果最佳，72 h 抑制效率下降，其可能原因是 siＲNA 的表达载体随着细胞的快速分裂而不断的丢失，从而降低了干扰效率。Ｒeal-time PCＲ 和 Western blot 法检测结果显示，转染 psiHBV/X 后 HepG2． 2． 15 细胞中MMP-2 在基因水平和蛋白水平的表达均下调，且随着时间的推移这种抑制越来越明显，提示沉默 HBx基因后 MMP-2 表达受到抑制，因此推测在 HCC 的转移过程中，HBx 或 HBV 可通过上调 MMP-2 的表达水平而增强肝癌细胞的侵袭能力，也增加了乙肝病毒致癌的可能性。提示 HBx 可作为控制肝癌转移的一个靶基因。
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