摘 要： 外泌体是由多囊体经胞吐作用释放出来的直径30～150 nm小泡体。外泌体由人体各种细胞分泌，其内含有来自细胞的蛋白质、核酸和脂质等成分，参与人类疾病的发生发展过程。尤其是参与或介导肿瘤细胞生长、侵袭和迁移、耐药、免疫逃逸、细胞凋亡。外泌体有望作为疾病诊断、预后分析、监测追踪的生物标记物，治疗靶点或药物载体，并为疾病的诊断、治疗、预后分析、监测追踪提供新思路及方法。本文综述了外泌体的生物学特性、提取方法及其在人类不同疾病中的应用潜能。
关键词： 外泌体; 生物学特性; 分离方法; 生物标记物; 诊断;
Abstract： Exosomes are small vesicular bodies(30 nm to 150 nm in diameter) released by exocytosis of multivesicular bodies(MVBs). Exosomes are secreted by various cells of the human body, which contain proteins, nucleic acids and lipids from cells and participate in the occurrence and development of human diseases. In particular, they participate in or mediate the growth, invasion and migration, drug resistance, immune escape, and apoptosis of tumor cells.Exosomes are expected to be used as biomarkers for disease diagnosis, prognosis analysis, monitoring and tracking, therapeutic targets or drug carrier, and provide new ideas and methods for the diagnosis, treatment, prognosis analysis, monitoring and tracking of diseases. This article reviews the biological characteristics and extraction methods of exosomes and their application potential in different human diseases.
Keyword： Exosomes; Biological characteristics; Separation methods; Biomarkers; Diagnosis;
外泌体(exosome)是细胞分泌的纳米级细胞外囊泡样体，它的直径30～150 nm，是一种膜囊泡，来源于体内各种活细胞分泌的晚期核内体(多囊泡体)。它广泛存在于血液、唾液、尿液、乳汁、胃液、胸水、脑脊液、腹腔和胸腔积液等多种体液中，含有蛋白质、核酸和脂类等生物活性物质，可通过生理屏障，参与细胞间物质交换及信息交流，在各种生理和病理过程中发挥着重要作用[1,2,3,4,5]。随着研究的不断深入，对外泌体中蛋白、核酸和脂类检测将有助于疾病的早期诊断、疗效评价和预后分析[2,3,4,5]。因此，本文综述了外泌体在人类疾病中的研究进展，以期为不同疾病的早期诊断及治疗、预后分析和监测追踪提供新思路及方法。
1 、外泌体的生物学特性
外泌体是由含有膜蛋白的脂质双层膜构成的小囊泡，其内含有蛋白、核酸、脂质等物质。外泌体主要含有以下蛋白：(1)四跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81、CD82);(2)膜运输和融合蛋白(GTPase、Rab蛋白、膜联蛋白、脂质筏标志性蛋白)；(3)参与多囊体生物合成相关蛋白(Alix蛋白、TSG101);(4)热休克蛋白(HSPs，如Hsp60、Hsp70、Hsp90);(5)脂质相关蛋白、磷脂酶；(6)细胞骨架蛋白(肌动蛋白、微管蛋白和膜突蛋白)[1,2,3]。外泌体携带大量核酸物质，包括miRNA、mRNA、DNA、长链非编码RNA、核糖体RNA及转运RNA等[4,6]。外泌体主要包含以下脂质[1]:(1)脂筏相关脂质(如胆固醇)；(2)鞘脂(如鞘磷脂和神经酰胺)；(3)磷脂；(4)甘油磷脂类(如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)。
外泌体形成及发挥作用的过程大致为以下几个步骤：首先分泌外泌体的细胞通过自身细胞质膜内陷吞噬自身细胞内的遗传物质(核酸、蛋白等)形成早期内体。然后早期内体发育成成熟的内体，并通过微粒体膜向内出芽形成多囊泡内体。在某些机制作用下，多囊泡内体与细胞膜融合，内部囊泡在被释放到细胞外形成外泌体。释放的外泌体可通过细胞吞饮作用和细胞膜融合等方式进入靶细胞，或者通过其表面配体与靶细胞表面受体相结合，影响靶细胞的代谢过程、信号通路转导和基因表达等。
2、 外泌体提取方法
2.1 、超速离心分离
该方法是基于外泌体的大小，使用超速离心进行外泌体的分离提取。主要提取过程是：⑴样本以300×g离心10 min，去除沉渣收集上清液，以去除活细胞及较大的杂质；⑵收集的上清液依次以2 000×g离心10 min和10 000×g离心30 min，均去除沉渣收集上清液，以清除死细胞和细胞碎片；⑶将最终收集到的上清液以100 000×g超高速离心70 min，去除上清液以收集沉淀，将沉淀以100μL PBS重悬纯化提取[7,8]。超速离心是研究人员最常用的方法，其优势主要是适用于各种类型的外泌体提取(细胞培养液、胸水积液、血清、尿液等)。但超速离心法存在以下不足之处：⑴完成多次离心需要消耗大量时间，不适合临床快速应用；⑵需要样本量较大；⑶超高速离心容易使得外泌体破裂导致外泌体量更少。
2.2、 蔗糖梯度离心法
该方法是基于外泌体的大小和密度，使用超速离心和蔗糖密度梯度进行外泌体的分离提取。外泌体可以在蔗糖密度梯度溶液中富集，密度范围为1.13～1.21 g/mL。使用这种方法已经成功从条件培养基、体液和组织中分离出外泌体[8,9]。主要提取过程是：前面的步骤与超速离心法分离提取方法相同，只是在100 000×g超高速离心时加入30%蔗糖缓冲液用于进一步纯化分离外泌体。该方法的优点是提取的外泌体纯度更高，但是该方法不但有与超高速离心相同的缺点而且步骤更加复杂，不适合大规模应用。
2.3、 超滤
该方法是基于不同孔径的膜分离并提取外泌体。主要提取过程是：利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。该方法具有提取高纯度外泌体的优点。缺点是洗脱效率低[10]。
2.4 、尺寸排阻液相色谱法
该方法是基于凝胶孔隙的孔径与样品的分子大小的相对关系分离溶质的分析方法[11]。主要提取过程是：利用尺寸排除柱含有不同直径纳米孔径的树脂，蛋白质和其他较小的污染分子的通过延迟，而较大的囊泡可以快速通过并在空隙体积中洗脱。该方法的优点是可以防止外泌体生物功能丧失。缺点是工作量大，不适合大样本的处理。
2.5、 免疫亲和珠分离法
该方法是基于表面标志物的表达吸附、分离外泌体。主要提取过程是：涂有抗靶抗体的磁珠标记吸附具有靶抗体的外泌体[12]。该方法的优点是对外泌体的捕获更具有亲和力和特异性。缺点是它只能用于提取高表达靶抗体的外泌体。
2.6、 ExoQuick提取法
该方法是根据聚合物共沉淀原理。这些试剂通常会降低外泌体的水化作用(从而降低溶解性)，从而导致沉淀。主要提取过程是：样品以3 000×g离心15 min，取上清；将上清过0.22μm一次性滤器，根据试剂要求步骤将得到的上清夜加入沉淀剂(4:1)，混均匀，然后在4℃放置30 min；将孵育好的样品以1 500×g离心5 min，弃上清，沉淀以100μL PBS重悬纯化提取。该方法的优点是操作简单，外泌体提取效率高。缺点是成本高，不适合大规模的样品处理[13]。
3、 外泌体在人类不同疾病中的研究进展
3.1、 外泌体蛋白的研究进展
由于外泌体中的白介素是一种集中表达于胃肠道部位的糖蛋白，因此其对胃肠道疾病的影响相当巨大，研究表明从炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)患者的肠道提取分离的外泌体中肿瘤坏死因子-α和白介素-10、白介素-6、白介素-8的水平更高，并且都与疾病严重程度相关[14]。外泌体中的β淀粉前体蛋白(APP)是一类广泛存在各种组织中，且集中表达于神经元突触部分的膜蛋白质。新近的研究发现阿尔茨海默病中一部分β-淀粉样蛋白由外泌体分泌，并且外泌体特异性蛋白在阿尔茨海默患者的斑块中被发现[15]。PERETS等[16]发现，间充质干细胞分泌的外泌体对脑部疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病和中风)具有特异性、靶向性和累积性。把外泌体靶向递送siRNA的BACE1抑制导致野生型小鼠的脑β-淀粉样蛋白水平显着降低，而Bace1介导的β-淀粉样蛋白斑块形成与阿尔茨海默病的发病机制有关[17]。
在癌症疾病中，外泌体中的各种成分蛋白质不管对癌症诊断还是对癌症用药的靶向治疗均具有巨大的潜在价值。癌症患者外泌体的蛋白含量显着高于健康人群。MELO等[18]通过大量的胰腺癌患者血清样本发现，与正常人相比，胰腺癌患者血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)阳性的外泌体占比显着增高。进一步研究发现，早期胰腺癌患者血清中GPC1阳性外泌体丰度显着高于正常人，该发现为胰腺癌的早期诊断提供了非常重要的基础。HANNAFON等[19]发现乳腺癌中外泌体含有转移相关蛋白1(metastasis-associated protein 1,MTA1)，并可将其转移至其他细胞导致肿瘤微环境中缺氧和雌激素受体信号发生转变。这表明外泌体MTA1介导的转移通能过修饰重要信号通路的细胞应答来促进乳腺癌的进展，表明外泌体MTA1可以作为乳腺癌的生物标志物和治疗靶点。HOSHINO等[20]通过蛋白质组学分析发现不同器官倾向性的肿瘤细胞来源的外泌体具有不同的整合素表达谱。整合素α6β1和α6β4参与肺转移，而整合素αvβ5参与肝转移，整合素α6β4和αvβ5的敲除减少了靶器官细胞获得的外泌体，从而分别减少了肺和肝转移。最后，通过临床数据分析，发现外泌体整合素蛋白可用作预测肿瘤转移的器官倾向性的指标。研究发现非小细胞肺癌患者的血浆外泌体黏蛋白1(MUC1)水平是健康人的1.5倍，两者之间的差异具有统计学意义，表明MUC 1被选择性地富集在外泌体中[21]，可能是诊断非小细胞肺癌的敏感生物标志物。研究发现非小细胞肺癌患者血浆外泌体中AHSG(alpha-2-HS-glycoprotein)和ECM1(extracellular matrix protein 1)与健康人相比明显高表达，联合检测血浆外泌体AHSG、ECM 1和癌胚抗原提高了诊断NSCLC的价值[22]。
近年来，外泌体作为一种免疫原性低、生物相容性高、给药效率高的药物给药系统而出现。氨基乙基乙醇胺(AA)是σ受体的高亲和力配体，已被用于靶向递送多柔比星(DOX)、蛋白质药物和siRNA。KIM等[23]开发并优化了一种含有氨基乙基乙醇胺-聚乙二醇(AA-PEG)载体修饰装载有抗癌药物紫杉醇(PTX)的外泌体以靶向肺癌细胞过度表达的σ受体AA-PEG载体外泌体负载PTX(AA-PEG-Exptx)具有较高的承载能力，系统给药后在癌细胞中积累能力强，治疗效果明显改善。靶向性与外泌体类药物的生物相容性相结合，为抗癌治疗提供了一个强大而新颖的载体。
3.2、 外泌体核酸的研究进展
miRNA是外泌体核酸的主要组成成分，miRNA可选择性组装到Exosomes中，然后稳定存在于患者的血液、尿液和其他体液中。miRNA的数量和组成在患者和正常人中存在差异，与疾病的发生发展密切相关，有望成为疾病诊断的标记物。
外泌体miRNA在癌症疾病的相关研究已相当深入，在癌症疾病诊断方面的潜在价值已经有许多新近研究证实。ENDZELI??等[24]发现通过检测血浆外泌体中mi R-200c-3p和mi R-21-5p的水平可以区分出前列腺癌和前列腺增生患者；血浆外泌体中Let-7a-5p水平可以区分Gleason评分≥8分和≤6分的前列腺癌患者。此外，研究发现胰腺导管癌患者中的外周血外泌体microRNA-10b、miR-30c、miR-21和miR-181a高表达和miR-let7a低表达可以很好地将胰腺导管癌与慢性胰腺炎患者及正常对照志愿者区分开[25]。而且最近研究表明，非小细胞肺癌中的腺癌特异性外泌体mi R-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p与鳞状细胞癌特异性外泌体miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b可以作为鉴别腺癌和鳞状细胞癌的肿瘤源性外泌体生物标志物，通过检测血浆中特异性外泌体有希望成为非小细胞肺癌早期诊断的高敏感性非侵入性方法[26]。
而在癌症疾病的发生、发展的进程中，外泌体miRNA也起到至关重要的作用，其参与肿瘤细胞的侵袭、增殖和转移各个方面，也正因为它的这种特性，其在肿瘤治疗方面也有不可估量的价值。CASABEI等[27]发现在脂肪肉瘤的外泌体中miR-25-3p和miR-92a-3p通过TLR 7/8依赖性方式刺激肿瘤相关巨噬细胞分泌促炎细胞因子IL6，并通过与周围微环境的相互作用促进脂肪肉瘤细胞的侵袭、增殖和转移。研究发现肝内星形细胞来源的外泌体miR-335-5p，在体外和体内均可被肝细胞性肝癌的癌细胞摄取，进而抑制体外培养的癌细胞增殖和侵袭能力，并诱导体内肝细胞癌的瘤体缩小[28]，该研究为肝癌的潜在治疗策略提供了线索。
同时在非肿瘤性疾病中如炎症及心血管疾病，外泌体中的miRNA也起到不可忽视的作用。EBRA-HIMKANI等[29]对多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)患者与健康对照组的血浆外泌体多种miRNA进行检测发现，外泌体miRNA不仅可以作为诊断MS的生物标志物，而且在预测疾病亚型方面具有很高的准确性。此外，研究发现从血管平滑肌细胞中分离出的外泌体过表达KLF5，是平滑肌细胞增殖和迁移的启动子。这些外泌体含有miR-155，被内皮细胞吸收后通过抑制内皮屏障功能，从而促使动脉粥样硬化斑块的形成及进展[30]。
3.3 、外泌体脂质的研究进展
外泌体的脂质主要包括神经酰胺、鞘脂、胆固醇和甘油磷脂等，外泌体脂质由于其脂溶性的特性，因此其更好的穿透各种生物屏障，因此其在泌尿疾病诊疗方面有不可估量的潜能。SKOTLAND等[31]采用高通量质谱定量脂质体分析方法对前列腺癌患者和健康对照者尿外泌体脂质组成进行分析，发现9种外泌体脂类的水平具有统计学差异，其中乳糖酰神经酰胺和磷脂酰丝氨酸(PS)最高，结果提示尿液外泌体中脂质类物质有望作为前列腺癌的生物标志物。DELBOCCIO等[32]利用脂质组学研究的微LC-Q-TOF-MS平台研究尿液外泌体脂质的全部特征。通过健康对照组和肾细胞癌患者尿液外泌体脂质的比较分析，初步鉴定了肾细胞癌尿外泌体的脂质组成差异，揭示了尿液外泌体脂质组成与肾细胞癌的关系。研究表明前列腺癌患者与正常人比较，外泌体脂质总量增加了1.5～2倍，直径<150 nm比直径>150 nm的外泌体增加幅度更大。另外研究还发现中性脂质如二酰基甘油和三酰甘油在所有外泌体中都会减少并且不依赖于外泌体的大小；尿液外泌体脂质分析有望成为鉴别前列腺癌生物标志物[33]。
4、 结语
综上所述，外泌体的研究及应用仍存在以下不足：其一，目前对外泌体分离及鉴定等相关技术仍不适用于临床大规模应用，研发出高效特异的外泌体分离和鉴定技术是解决外泌体临床应用的关键；其二，外泌体具备靶向特定器官或组织的潜能，有望通过促进或抑制外泌体的分泌来治疗疾病，然而，外泌体具有双重或多元效应，不同来源或载有不同核酸和蛋白的外泌体对同一类型肿瘤细胞有着双重影响，甚至相同来源的外泌体对肿瘤细胞增殖和侵袭作用并不一致，其作用机制及对机体产生的影响仍有许多问题亟待解决；其三，外泌体具有成为治疗药物载体的巨大潜力，然而外泌体产量低，会被肝脏的巨噬细胞快速清除，以及将功能分子或抗癌药物加载到外泌体制备成靶向药物的研发工作才刚刚起步，这些都是日后需要解决的难题。
外泌体含有来自细胞的分子，携带的蛋白质、核酸和脂质参与了人类疾病的发生发展过程，参与或介导肿瘤细胞生长、侵袭和迁移、耐药、免疫逃逸、细胞凋亡等。外泌体有望成为疾病诊断、预后分析、监测追踪的生物标记物，治疗靶点或药物载体，并为疾病的治疗、预后分析、监测追踪提供新思路及方法，这些都是外泌体研究领域的热点，值得进一步深入研究。
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