EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)属于γ疱疹病毒亚科,能够感染全球90%的人类,是最早被发现与肿瘤相关的病毒。它与多种人类疾病尤其是恶性肿瘤相关,其中包括单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、霍奇金病和鼻咽癌。二十世纪九十年代,有研究表明EBV还与胃癌和乳腺癌相关。而EBV是如何侵入宿主细胞,如何与宿主细胞相互作用,进而影响疾病发生发展,这都是研究者一直关注和研究的。
EBV侵入细胞是其感染宿主细胞以致发生作用的第一步。这一步一般包括病毒到细胞表面的附着和病毒包膜与细胞膜的融合。由于淋巴细胞表面具有EBV感染的受体,EBV能直接感染侵入B淋巴细胞并使其永生化。研究发现,在多种上皮细胞肿瘤中,有EBV的感染,而上皮细胞缺少像B淋巴细胞上的受体。因此,了解EBV是如何感染进入宿主细胞,尤其是上皮细胞,有利于在体外建立合适的细胞模型及深入研究EBV相关肿瘤发生发展的机理。尽管对EBV侵入各类细胞的认识仍不全面,但研究者也提出了EBV进入细胞的几种机制,并确定许多该过程的主要参与者。这里主要阐述EBV进入B淋巴细胞与上皮细胞的机制。
1B淋巴细胞EBV原发性感染通常发生在童年时期,没有明显的临床症状,然而年纪较大的孩子以及青少年在感染EBV后,就有可能导致传染性单核细胞增多症,这是一种自我限制性的淋巴组织增生性疾病。
静止期的人类B淋巴细胞是EBV在体内和体外都能感染的初始靶细胞。在被感染之后,病毒能够终生潜伏在B淋巴细胞中。那么,EBV是如何进入B细胞的?多年研究发现,EBV感染B淋巴细胞的机制主要涉及病毒包膜糖蛋白gp350/220与B细胞表面受体CR2的相互作用以及另外几种病毒糖蛋白gp42、gB、gH和gL的相互作用。
EBV附着于B淋巴细胞,主要依赖于EBV表面包膜糖蛋白gp350/220与B淋巴细胞膜上表达丰富的CR2结合,但它并不是绝对的。EBV借助gp350/220与B淋巴细胞膜上表达丰富的CR2结合,从而侵入B淋巴细胞的这一过程,是为人所公认的,占有主导位置的侵入方式。
EBV基因BLLF1编码的gp350/220是一种高度糖基化的单跨膜蛋白,对CR2具有高度亲和力,gp350/220有三个区域,分别是多肽11382、11389和11416序列,参与EBV与B淋巴细胞的侵入。成熟的CR2分子量为145kD,单链跨膜糖蛋白,其胞外区域由串联重复的序列60到75的氨基酸的结构模块组成,称为短同源重复序列SCR(Shortconsensnsrepeats)。SCR1与SCR2上的结构域可以与gp350/220结合。
gp350/220与B淋巴细胞表面受体CR2的相互作用,可以活化许多细胞通路,特别是NK-kB信号通路,能够引起IL-6上调,也能诱导受体的加帽以及病毒进入B淋巴细胞的胞吞作用,还能在病毒的释放过程中发挥作用。
在较低的pH环境下,gp350/220与CR2结合,构象发生改变,使得病毒进一步接近宿主细胞,利于EBVgp42与HLA-II(HumanleukocyteantigenclassII)类分子结合。糖蛋白gp42,为病毒基因BZLF2编码的产物,能与B淋巴细胞表面的HLA-Ⅱ类分子结合,将信息传送给gHgL复合物,从而启动膜的融合过程,并且这种相互作用可以阻断T细胞受体对复合物的识别,可能帮助病毒逃避免疫系统的检测。缺乏HLA-Ⅱ类分子的B淋巴细胞不能受到病毒的重复感染,而在HLA-Ⅱ类分子表达恢复的情况下则可以。类似的,EBV缺乏gp42的表达,不能感染B淋巴细胞,若有可溶性的gp42能再与gHgL结合形成复合物,则可以感染B淋巴细胞。但又有研究表明,gp42的N-末端多肽氨基酸序列从36~81这一区域,可以抑制膜的融合,这可能与gp42不参与病毒和上皮细胞的融合机制有关。在病毒包膜与B淋巴细胞膜的融合过程中,病毒糖蛋白gp42,gH和gL以1∶1∶1的比例构成稳定复合物而发挥作用。
gH是病毒基因BXLF2编码的产物,参与病毒包膜与宿主细胞膜融合,其尾部的丝氨酸-缬氨酸-脯氨酸(SVP)基序为融合过程所必须。缺少gH的EBV重组体不能发生细胞膜的融合。
gL可能与异源三聚体复合物(gHgLgp42)中的gp42相互作用,对EBV与B淋巴细胞的融合很重要,但更多的研究表明,这一相互作用中gH起到了主要的决定作用,而由BKRF2编码的gL,则有助于gH转运与加工,还能活化或招募gB与复合物gHgL的功。此外,在病毒与细胞融合过程中还需要病毒糖蛋白gB的参与。它是疱疹病毒家族中的保守蛋白,含有氨基末端胞外域,其C末端能够调节诱导膜的融合,影响自身在胞内的定位。其胞质尾区包含两个区域,在膜融合的过程中也有不同的功能。氨基酸序列802至816构成的这一区域对有效地膜融合是必须的,而序列817至841所包含的区域则负调控gB诱导膜融合的功能。
PlateAE等研究发现,EBVgB氨基酸序列456至807这一区域,在EBV与B淋巴细胞融合过程中,会影响gB与gHgL的相互作用。
2、上皮细胞EBV
相关的恶性肿瘤可能起源于EBV感染的B淋巴细胞与上皮细胞。众所周知,在体外,EBV能轻易的感染B淋巴细胞,而对于感染上皮细胞却很难实现。EBV感染上皮细胞的机制比感染B淋巴细胞的机制要复杂得多。因此,EBV侵入上皮细胞的机制仍是研究热点。目前,大致有三种EBV感染上皮细胞的模式,以下分别进行阐述。
2.1第一种模式:
B淋巴细胞或郎罕氏细胞介导的EBV感染上皮细胞模式①EBV借助B淋巴细胞感染上皮细胞B淋巴细胞是EBV感染上皮细胞的一种理想媒介。用EBV阳性的淋巴样干细胞与上皮细胞进行共培养,能够使EBV成功感染上皮细胞。
EBV阴性的人鼻咽癌细胞系HONE1、TW-10能通过与EBV感染的Akata细胞共培养来实现EBV对鼻咽癌上皮细胞的感染,并在感染的鼻咽癌细胞系中,能检测到EBV基因组,如EBNA1、LMP1、LMP2A和LMP2B。新鲜B淋巴细胞或记忆B淋巴细胞有效地介导EBV感染上皮细胞,感染效率达到5%~25%。
CDShannon-Lowe等研究发现EBVgp350/220与B淋巴细胞表面受体CR2相结合,触发B淋巴细胞与上皮细胞相互接近,在足够接近的时候,EBV利用自身蛋白gH、gL、gB等与上皮细胞上相应的受体(详见2.2EBV依赖自身蛋白与上皮细胞上相关受体相互作用,感染上皮细胞)相互作用,激发上皮细胞的内吞作用,进入上皮细胞。因此,EBVgp350/220与B淋巴细胞表面受体CR2相结合,触发B淋巴细胞与上皮细胞相互接触,而这种细胞之间的接触一旦确立,B淋巴细胞上的EBV就能在其介导下侵入上皮细。EBV通过淋巴细胞转移感染上皮细胞,仍为实验室建立EBV感染的上皮细胞系的一个有效且实用的方法。我们用带有GFP标记,并含有EBV全基因组的病毒质粒建立稳定293细胞,再通过共转质粒BZLF1、BALF4,使293细胞中的病毒质粒由潜伏期转变为裂解期,从而产生重组的EB病毒颗粒,然后借助B淋巴细胞的介导作用,“转移感染”其他鼻咽癌上皮细胞,而成功感染EBV的上皮细胞,能够表达绿色荧光蛋白。但是在多次传代过程中,荧光越来越少,表明EBV在逐渐的丢失,而其中的机制也是我们正在探索的一个课题。有研究表明在hTert永生化的鼻咽上皮细胞中,过表达cyclinD1后,能够促进EBV稳定的潜伏感染。
EBV通过郎罕氏细胞,感染上皮细胞DennisMWalling等通过对郎罕氏细胞的相关研究,提出EBV感染上皮细胞的一种新的模型。
郎罕氏细胞,是一种树突抗原递呈细胞,定居于皮肤和粘膜上皮的基底层。骨髓来源的郎罕氏细胞前体在血液循环中,能够迁移至上皮,并分化为郎罕氏细胞。研究发现,部分郎罕氏细胞前体能够表达CR2,在血液循环过程中,受到EBV的潜伏感染,从而作为EBV的一种运输工具,随其迁移至上皮,分化为EBV感染的成熟的郎罕氏细胞。而这种细胞的触角存在于上皮组织中,在EBV裂解复制状态下,病毒颗粒能够与CR2阳性的上皮细胞上的CR2结合,或者利用这些触角与周围上皮细胞接触,类似于B淋巴细胞,通过内吞作用侵入上皮细胞,而后者,可能与整合素有关。
2.2第二种模式:
EBV依赖自身蛋白与上皮细胞上相关受体相互作用,感染上皮细胞作为一种有包膜的病毒,EBV侵入细胞是通过它的包膜与细胞膜相融合实现的。前已述及,EBV与B淋巴细胞的进入过程需要gp350/220、gp42、gB、gH和gL四种包膜糖蛋白,而进入上皮细胞的过程中除了涉及其中gp350/220、gB、gH和gL以外,还有BMRF2、整合素等分子的参与。
能够表达CR2分子的上皮细胞,能以与B细胞类似的方式受到EBV感染某些能够表达CR2的上皮细胞,可以类似于EBV侵入B淋巴细胞的过程,受到EBV的感染。利用重组EBV毒株感染CR2阳性的人胚肾细胞系(293),发现EBV成功感染293细胞,但由于该细胞系CR2低表达,其感染效率相较于EBV感染B淋巴细胞的效率要低得多。若293细胞与CR2特异性抗体共同孵育后,重组EBV毒株则不能感染该上皮细胞系,表明EBV对293细胞系的感染是由细胞表面人工表达的CR2分子介导。
EBV依赖gHgL、gB,直接侵入上皮细胞gp42能够触发EBV包膜与B淋巴细胞膜的融合,却阻碍EBV与上皮细胞的融合,即未参与对上皮细胞的感染过程。而且,上皮细胞始终缺乏HLAII类分子组成型表达,其融合过程仅涉及gB和复合物gHgL。gH有利于EBV附着与进入上皮细胞,而且gHgL上的KGD模序,是一个具有双重功能的区域,其突变体能够降低与B淋巴细胞和上皮细胞的融合,也能够降低gHgL与上皮细胞和gp42的结合。
gH的抗体对B淋巴细胞的转化没有影响,但能够影响对上皮细胞的感染。在gH残基594处,将丙氨酸替换为甘氨酸,可以彻底阻碍EBV与B细胞和上皮细胞的融合,但在残基595处,将丙氨酸替换为谷氨酸,则只是减少与上皮细胞的融合,且能加强与B淋巴细胞的融合。
EBVgB在EB病毒包膜与上皮细胞膜的融合过程中有重要的作用。它的CTD(C-terminalCytoplasmicTailDomain)不仅能够影响病毒糖蛋白gB的表达以及其在细胞内的定位,而且能够调节gB促进EBV与宿主细胞的融合功能。突变CTD某一区域后发现,病毒蛋白的细胞内定位发生了变化,不同的宿主细胞,在融合过程中,与野生型的进行比较,也表现出了不同的实验结果。而且结构保守的糖蛋白gB,在缺少异质二聚体gHgL的情况下不能介导融合过程。但在gB缺少的情况下,gHgL可以介导膜的半融合。
EBVBMRF2与整合素,参与病毒进入宿主细胞EBV侵入不同类型的宿主细胞,要求不同的糖蛋白的参与,gHgL与gHgLgp42的相对含量会影响EBV感染的趋性。缺乏gH的病毒颗粒不能感染上皮细胞,可溶的gHgL可以结合到上皮细胞上,表明上皮细胞上存在着相应的gHgL受体。然而,上皮细胞表面究竟是哪一种或一类分子能与gHgL相结合,来触发融合过程还不是很明确。有文献报道,EBV的另一种糖蛋白,BMRF2蛋白,能与整合素β1、α3、α5和αν相结合,但整合素与BM-RF2蛋白相应的抗体只能部分阻断EBV与极化上皮细胞的融合。BMRF2与β1整合素可以介导EBV的附着与进入。其中,β1整合素的糖基化对发挥其功能,非常关键,只有它的成熟形态才能结合GST-BMRF2RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)和纯化的病毒体到达细胞表面,在EBV的附着与进入起到一定的作用。随后ChesnokovaLS等人发现,整合素ανβ5、ανβ6和ανβ8能够作为与gHgL相结合的特殊受体,触发病毒与上皮细胞质膜的融合。
gH上的亮氨酸残基序列中有能与ανβ6和ανβ8相结合的区域,使gHgL的构象发生改变,进而影响gHgL与gB的相互作用。然而,BMRF2与整合素的相互作用是否直接参与EBV的附着或其随后的事件,则需要进一步的研究才能证实。
Sc与IgA相互作用,通过内吞作用,使得EBV进入宿主细胞EBV衣壳蛋白的抗体多聚IgA,有可能介导EBV侵入上皮细胞。多聚IgA普遍存在于人类唾液中,可结合Sc蛋白,来促进EBV内吞,转移至上皮细胞。Sc(Secretorycomponent)蛋白是一种横跨膜蛋白,在上皮细胞,假复层上皮细胞及中间鳞状上皮细胞的基地外侧表面表达。来自单核细胞增多症患者的IgA与EBV相互作用,形成EBV-IgA复合物,而后感染HT29恶性腺癌细胞系,研究发现,细胞中有BZLF1和早期抗原(EAD),同时,PCR也检测到EBVDNA。因此,EBV-IgA-Sc复合物可以介导EBV通过内吞作用进入上皮细胞。随后的研究发现,在鼻咽癌中,有Sc的存在。通过这一复合物,可以实现EBV感染的鼻咽癌细胞系的建立。但是,在这一过程中,是否还有其他蛋白的参与,则需要进一步的研究。
2.3第三种模式:已感染
EBV的上皮细胞,可以将产生的病毒颗粒传递给邻近的细胞与EBV诱导的淋巴样干细胞共培养的上皮细胞能够被EBV感染,同时,游离的EBV病毒颗粒经口咽部上皮细胞基底外侧膜直接感染这些细胞。因此,来自于已感染病毒的上皮细胞释放的EBV也能直接通过细胞侧膜感染邻近的上皮细胞,这种细胞与细胞之间的感染也是EBV感染细胞的一种方式。而这一过程,可能涉及EBV其他蛋白以及宿主细胞上相应受体的相互作用,如EBVBMRF-2与整合素的相互作用。然而,这一方式备受争议。
EBV在原发性感染上皮细胞时,是依赖于B淋巴细胞的接触感染,且在感染邻近上皮细胞时,病毒颗粒的复制产出是在初始感染的上皮细胞中发生的。但是,感染病毒的B淋巴细胞所释放的EBV颗粒,缺乏gp42,能够有效地感染上皮细胞,而对于感染B淋巴细胞效率相对较低。相反地,在EBV感染的上皮细胞中,gp42可以重新定位在病毒囊膜上,所释放的病毒颗粒能够高效感染B淋巴细胞,不利于EBV与上皮细胞的融合。
3、小结与展望
EBV侵入宿主细胞后,会潜伏在宿主细胞中,或是立即进行裂解性复制,其基因组以随机整合或游离的形式存在于细胞中。越来越多的证据表明,EBV潜伏感染基因组的存在在相关肿瘤的发生发展中起重要作用。血清学和组织病理学的检查也表明,EBV基因组在肿瘤细胞或组织中的存在伴随着肿瘤的整个发生过程,尤其是在低分化和未分化的NPC上皮肿瘤组织中,几乎所有肿瘤细胞中含有EBV基因组。作为一种外来的病毒抗原,尽管在其感染静止期的B淋巴细胞后,会激发B淋巴细胞的大量扩增,并引起一种有效地T细胞反应来抵抗病毒抗原,从而控制感染的B细胞。但是,这种免疫反应,并不能清除病毒。那么在这些异常的鼻咽组织细胞中,是否又有某些免疫因子能够促进EBV进入宿主细胞;在EBV再次进入已感染的宿主细胞时,EBV在细胞中表达的产物是否对EBV的再次进入有促进作用;以及在微环境中,是否有更多的未知其他分子协助该过程的发生等。这都可以作为进一步研究其机制的思考方向。因此,了解EBV感染进入宿主细胞的方式和机制,对于及早切断其在细胞内发生作用的途径具有重要意义。同时,EBV感染上皮细胞的第一种模式中,通过B淋巴细胞转移感染的方式已成为应用于实验室建立EBV感染的上皮细胞模型的有效手段,这解决了一大实验难题。所以,了解EBV感染模式也为相关的机制研究提供了重要的理论依据。
随着研究的越来越深入,研究者发现EBV参与更多的肿瘤发生发展,对其的研究也更为关注。EBV是如何与细胞相互作用、如何影响EBV相关肿瘤的发生发展、以及如何寻找针对EBV的相关肿瘤的诊断和治疗的分子标志物,一直都是当前相关领域中的国际前沿科学问题。这些问题的探讨与研究,都是从了解EBV进入宿主细胞的机制开始的。
而要彻底的弄清楚这一机制,则需要研究者们付出更大的努力。
