人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)属 β 疱疹病毒亚科，为双链线状 DNA 病毒，常可引起孕妇宫内感染或围生期感染，导致胎儿或新生儿各种畸形和疾病。在免疫低下状态人群(如艾滋病、器官移植等患者) 中，HCMV 可引起致死性感染，危及生命。HCMV 可直接攻击和损伤宿主细胞。随着对病毒与细胞趋化性研究的深入，HC-MV 趋化因子作用引起学者的广泛重视。我们前期小鼠体内研究也表明，HCMV 感染可引发大量单核细胞和淋巴细胞浸润。
HCMV 具有编码趋化因子及其受体类似物的基因，其感染后所编码的趋化因子及其受体类似物，干扰机体正常的细胞因子及其受体的生理功能，参与某些巨细胞病毒疾病的病理改变，导致病毒在体内扩散、增殖和潜伏; HCMV 感染还可导致机体其他多种炎症因子的产生，如 TNF-α、IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子(GSF) 等; IL-6 和 GSF 参与 HC-MV 感染相关的血管性疾病的形成。从致病机制而言，病毒除直接攻击宿主细胞致宿主损伤外，其编码的趋化因子及其受体类似物可通过促进机体相关炎症因子的释放，趋化活化炎症细胞至损害部位，加重宿主损伤。
炎症抑制因子通过抑制细胞合成和分泌炎症相关细胞因子、促炎因子等途径，抑制炎性细胞的浸润，从而抑制炎症的发生。地塞米松属于长效的糖皮质激素类药物，具有广泛的抗炎作用。那么，地塞米松是否能够影响 HCMV 感染所致的炎症反应?
在 HCMV 感染后，应用地塞米松是否能抑制炎症细胞的趋化，进而减轻宿主的损害? 因此，本实验在研究 HCMV 体外趋化 PBMC 功能的同时，设不同质量浓度的地塞米松研究其对 HCMV 趋化作用的影响。
1、 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 细胞 人胚肺成纤维细胞(human embryon-ic lung fibroblast，HELF) 由美国菌种保藏中心 ATCC提供，按常规方法培养、传代，本实验采用第 10 ～20代。PBMC 按常规方法从健康志愿者外周血中提取、培养。
1． 1． 2 病毒 HCMV AD169 株由安徽医科大学微生物教研室提供，按常规方法接种、传代、滴定，并测定半数组织培养感染量(tissue culture infective dose，TCID50) 为 10－ 4． 6。
1． 1． 3 主要试剂 高糖 DMEM、ＲPMI 1640 均为Gibco 公司产品，新生小牛血清、胎牛血清均为杭州四季青公司产品，人外周血淋巴细胞分离液为天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品，PBS、胰蛋白酶均为 Amresco 公司产品，二甲基亚砜(DMSO) 、四甲基偶氮唑盐(MTT) 为 Sigma 公司产品，地塞米松注射液(5 mg/mL) 为华中药业股份有限公司产品。
1． 1． 4 主要仪器 CO2细胞培养箱(Heraeus 公司) ，倒置显微镜(德国 Leica 公司) ，酶标仪(Anthos公司) ，高速冷冻离心机(Eppendorf 公司) 。
1． 2 方法
1． 2． 1 检测地塞米松对 HELF 的毒性 收集对数期 HELF，计数并调整细胞悬液浓度，加入 96 孔细胞培养板中，每孔 100 μL，此时细胞密度约 103～104/ 孔，边缘孔用无菌 PBS 填充，以防边缘效应。于37 ℃ 、5% CO2培养箱中培养至孔底铺满单层细胞，此时细胞密度约 105/ 孔。将地塞米松注射液与含3% 小牛血清的高糖 DMEM(不加双抗) 以不同比例混匀，配制成 0． 125，1． 25，12． 5，25，50，100，200 μg/mL 质量浓度的地塞米松溶液。将上述不同质量浓度梯度的地塞米松依次加入 96 孔板中，每孔 200μL。设不加地塞米松的 HELF 组为正常对照组，加不同质量浓度地塞米松的 HELF 为实验组，每组各设 5 个复孔。调零孔则加入 200 μL 培养液。于 37℃ 、5% CO2培养箱中培养，每天显微镜下观察细胞毒性变化。约 4 d 后，弃培养液，加 MTT 染色液，20μL/孔 (质量浓度为 5 mg/mL ) 。于 37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养4 h，肉眼可见细胞中有蓝紫色甲赘结晶形成，弃染色液，加 DMSO，100 μL/孔。避光低速振荡10 min，使蓝紫色甲赘结晶充分溶解，室温下静置 5 min，于酶标仪 490 nm 处测各孔光密度(D) 值，计算细胞存活率。细胞存活率(%) = 实验组平均 D 值/对照组平均 D 值 × 100%。换算出地塞米松对 HELF 的半数中毒浓度(TC50) ，推算出最大无毒浓度(TC0) ，实验重复 3 次。
1． 2． 2 PBMC 的提取与培养 取新鲜肝素抗凝人外周全血 30 mL，与 PBS 等体积混匀。取 15 mL 离心管数个，每管加入 6 mL 淋巴细胞分离液，小心地沿管侧壁注入 6 mL 经 PBS 稀释后的外周血，使其处于分离液液面之上。以 2 000 r/min 离心 20 min，此时离心管内由上而下细胞分 4 层: 血浆层、环状乳白色淋巴细胞层、透明的淋巴细胞分离液层、红细胞层。轻轻吸取第 2 层约 1 ～ 2 mL，移至另一离心管中。加入 5 mL PBS，充分混匀，以 2 000 r/min 离心20 min，弃上清，反复清洗沉淀 2 次，以去除淋巴细胞分离液、血小板等杂质，得到所需细胞。用 1 mL含 10%胎牛血清的 ＲPMI 1640 培养液重悬细胞，取10 μL 于细胞计数板，显微镜下计数，每 1 mL 外周全血可得到 106～ 107个 PBMC。将细胞悬液加入培养瓶中，加入 5 mL 含 10% 胎牛血清的 ＲPMI 1640完全培养液，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 1 d备用。
1． 2． 3 HCMV 体外感染 HELF 取数块已铺有单层 HELF 的 24 孔板，每块板分别加入 5、10、20、40、60、80、100、1 000 TCID50的 HCMV AD169 毒株，37℃ 、5% CO2培养箱中吸附 1． 5 h，更换等量细胞维持液(含 3% 小牛血清的高糖 DMEM) 。分别于 24、48、72、96 h 终止培养。每次终止培养时，每板各取3 孔感染上清，4 ℃ ，12 000 × g 离心 30 min，以去除上清液中的病毒及细胞碎片。
1． 2． 4 趋化性实验 将上述离心后上清分别加入24 孔 5 μm Transwell 趋化板的下室。将“1． 2． 2”中获得的 PBMC，用不含血清的 ＲPMI 1640 培养液配置成约 106/ mL 的细胞悬液，加入 Transwell 趋化板的上室，每孔 100 μL。将趋化板置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 1． 5 h。于显微镜下计数落入下室中的 PBMC; 每孔随机选取 5 个高倍视野，计算细胞总数。每组均设3 个复孔。选出趋化作用最强时的病毒浓度及培养时间。
1． 2． 5 地塞米松对 HCMV 感染上清趋化作用的影响 在呈单层贴壁生长的 HELF 24 孔细胞培养板中，接种“1． 2． 4”中选出的 HCMV，吸附 1． 5 h 后，更换含不同质量浓度地塞米松的 DMEM，每个实验小组均各设 3 个复孔。于 37 ℃、含 5% CO2培养箱中培养数天后，收集各培养上清，4 ℃ 12 000 × g，离心30 min，重复“1． 2． 4”的方法检测各组对 PBMC 的趋化实验。
1． 2． 6 灭活病毒感染上清的趋化作用 在铺有单层 HELF 的 24 孔板中，分别接种灭活 HCMV(经紫外线照射 10 min) 、“1． 2． 4”选出的 HCMV，吸附 1． 5h 后，更换 DMEM 细胞维持液。同时设正常 HELF细胞为对照组。每组均各设 3 个复孔。于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养数天后，收集各培养上清，离心后重复“1． 2． 4”的趋化实验。
1． 3 统计学处理
应用 SPSS 18． 0 软件，数据用 x珋 ± s 表示; 依据细胞存活率和抑制率，采用 Probit 回归法计算出地塞米松对 HELF 的 TC50和 TC0; 多个样本间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t检验或 Dunnett-t 检验，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2、 结果
2． 1 地塞米松对 HELF 细胞的毒性作用
结果如图 1 所示，地塞米松在 100 μg/mL 以下时对 HELF 细胞无明显的毒性作用，而大于100 μg/mL 时，细胞毒性作用明显，镜下表现为细胞数量减少，形态不一，甚至坏死脱落。根据细胞存活率得出地塞米松的 TC0为100 μg/mL; 根据 Probit 回归法计算出地塞米松的 TC50为 92． 05 μg/mL。
2． 2 HCMV 感染 HELF 后的上清趋化 PBMC 的作用
比较不同浓度的病毒培养上清在不同培养时间下对 PBMC 的趋化作用，结果显示，5 TCID50与 10TCID50之间，80 TCID50与 1 00 TCID50之间，1 00TCID50与 1 000 TCID50之间，培养 24，48，72，96 h 时趋化作用差异均无统计学意义(P 均 ＞ 0． 05) 。10TCID50与 20 TCID50相比，20 TCID50与 40 TCID50相比，培养 24，48，72 h 时趋化作用差异均无统计学意义(P 均 ＞0． 05) 。同一浓度病毒，培养 24 h 与 48 h之间趋化作用差异均无统计学意义(P 均 ＞0． 05) ，培养 48 h 与 96 h 之间，72 h 与 96 h 之间趋化作用差异均有统计学意义(P 均 ＜ 0． 05) ，除 10 TCID50外，培养48 h 与72 h 之间趋化作用均有统计学意义(P 均 ＜0． 05) 。
由图 2 可见，HCMV 感染 HELF 后的上清具有趋化 PBMC 的作用，且在一定范围内(5 TCID50～ 80TCID50) ，随着病毒浓度的增加，趋化作用增强; 当浓度超过 80 TCID50时，趋化强度增加则不明显; 随着培养时间的延长，尤其是在 72，96 h，趋化作用也不断增强。所以，我们选择 80 TCID50浓度的病毒，培养时间为 96 h，进一步实验。
2． 3 地塞米松抑制病毒上清对 PBMC 的趋化作用
如图 3 所示，与对照组(0 μg/mL) 比较，1． 25μg/mL 和 12． 5 μg/mL 地塞米松对 HCMV 感染上清介导的 PBMC 趋化作用无明显影响(t1． 25= － 0． 09，t12． 5= － 1． 80，P 均 ＞ 0． 05) ，其余质量浓度地塞米松与对照组相比，差异均有统计学意义(t25= － 5． 23，t50= － 8． 66，t100= － 12． 7，P 均 ＜ 0． 01) ，提示地塞米松对 HCMV 感染上清介导的 PBMC 趋化作用具有一定的抑制作用，且随着地塞米松质量浓度的增加，趋化作用减弱(F 值 =52． 75，P ＜0． 01) 。
2． 4 灭活病毒感染上清介导的 PBMC 趋化作用弱于正常病毒感染上清
与正常病毒感染上清介导的 PBMC 趋化作用比较，灭活病毒感染上清介导的趋化作用明显减弱，正常细胞 +灭活 HCMV 组中迁移细胞数约为正常细胞 +80 TCID50HCMV 组的 1 /3。正常细胞 + 80 TCID50HC-MV 组中迁移细胞数约为正常细胞组的 4． 5 倍。
3、 讨论
近来研究表明，炎症反应在 HCMV 感染的发病机制及病情进展的过程中发挥重要作用。本实验旨在从整个病毒培养上清的角度，研究其趋化作用。
HCMV 具有编码趋化因子及其受体类似物的基因，包括 UL128、UL146 和 UL147 等趋化因子类似物基因，US27、US28、UL33 和 UL78 等趋化因子受体类似物基因。研究显示，HCMV 编码的趋化因子类似物属于分泌性、亲水性蛋白。本实验可推测，病毒感染上清中可能存在 HCMV 编码的趋化因子或其受体类似物。在对 UL146 的研究中发现，从HCMV Toledo 株感染后 72 h 开始，病毒基因转录编码的 UL146 基因产物显著增多。本实验结果显示，HCMV 介导的趋化作用在72 h 和96 h 显著增加(图 2) ，据此可推测，病毒编码的趋化蛋白主要为病毒晚期基因产物。
Transwell 趋化板分上、下室，中间以一层薄膜分隔，巧妙地模拟了体内环境血管壁分隔的组织细胞与血细胞。本实验证实了 HCMV 感染后的上清具有趋化 PBMC 的功能。结果显示，并不是病毒浓度越高，趋化作用越强，80、1 000 TCID50病毒趋化作用差异无统计学意义。可能的原因如下: 病毒浓度过高，抑制正常细胞的生长，甚至破坏细胞结构，使其裂解，进而病毒复制表达的能力受到抑制，产物蛋白的量也受到影响; Transwell 上室 PBMC 的量是一定的，所以相应的趋化因子受体的量也是有限的，在一定范围内，病毒浓度越高，蛋白产物也越多，但是受体饱和时，趋化作用的差异就无统计学意义了。
地塞米松是一种临床常用的长效糖皮质激素类药物，具有广泛的抗炎作用，除了对骨关节炎、创伤性中耳炎、急性肝损伤等引起的相关炎症反应具有抑制作用，对病毒所致的炎症反应也有影响，如病毒性脑炎、病毒性角膜炎等。本实验证实地塞米松对HCMV 感染后的上清趋化 PBMC 的功能具有一定的抑制作用，因此提示，当病毒感染时，使用激素要特别注意，否则会抑制机体单核细胞的免疫功能，加重病情; 但其具体抑制机制不明，可能与其对病毒编码的趋化分泌蛋白功能的影响、抑制 HELF 细胞增殖、促凋亡、影响细胞钠通道等有关，有待进一步研究。
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