摘 要： 面对复杂的全球新冠疫情防控形势，中国计量科学研究院前沿计量科学中心生命科学计量团队持续攻关，成功研制新冠假病毒核糖核酸标准物质。本标准物质安全性高、无生物污染性，可为核酸提取定量测量全流程操作提供测量标准，有助于核酸检测实验室质量控制和能力建设，解决检测结果的量值溯源性，为完善新冠病毒精准测量系统，更好地服务国内外新冠疫情防控提供了新的计量技术支撑。
关键词： 新冠假病毒; 标准物质; 全流程核酸检测; 量值传递;
一、研究背景
新冠病毒精准检测是加强疫情防控的重要手段。因此，有必要持续开展新冠病毒检测标准物质研究，完善新冠病毒精准测量系统，以更好地为我国新冠疫情防控提供全面的计量技术支撑。
新冠病毒核酸标准物质是RNA转录子和RNA基因组形式，可以对分析方法进行质量控制和验证，在提升新冠病毒核酸检测结果准确性方面发挥了重要作用，不足之处是无法参与新冠病毒核酸提取过程，从而无法对提取过程进行质量控制和评估。如何构建一种可以模拟病毒从RNA提取至核酸扩增检测全过程的新冠假病毒核糖核酸标准物质，是一个急需解决的难题。因此，研制不依赖于生物安全三级实验室条件的新冠假病毒核糖核酸标准物质，将填补国内在新冠病毒检测领域假病毒核糖核酸标准物质的空白，对于规范、评价各种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，实现新冠病毒核酸检测全流程质量控制、检测结果量值溯源起到重要作用。
二、新冠假病毒核糖核酸标准物质研制
中国计量科学研究院前沿计量科学中心生命科学计量团队持续攻关，开展了新冠假病毒核糖核酸标准物质候选物设计、纯化、表征和稳定保存等关键技术研究，成功研制新冠假病毒核糖核酸标准物质（NIM-RM5203），并迅速推广应用。
新冠假病毒核糖核酸标准物质是将新型冠状病毒重要特征基因核衣壳蛋白N基因（全长）、包膜蛋白E基因（全长）和开放阅读框1ab(ORF1ab）基因片段（基因组坐标：13201-15600、18500-19000以及Gen Bank No.NC＿045512）克隆至慢病毒载体p CDH上，构建出包装有新型冠状病毒重要特征基因RNA的假病毒。经荧光定量PCR扩增方法验证了本标准物质的颗粒纯度，并采用自主研制的假病毒保护剂进行稀释分装，置于-70℃保存。
利用满足计量学特性要求、经国际物质量咨询委员会（CCQM）核酸分析工作组（NAWG）认可的数字PCR(d PCR）绝对定量测量方法[1,2]和经检定/校准的容量计量器具，测量每管溶液中含有的病毒E基因、ORF1ab基因和N基因的拷贝数浓度，得到该新型冠状假病毒核糖核酸标准物质的特性量值，详见http://h-s.www.ncrm.org.cn.forest.naihes.cn/Web/Material/Component s?auto ID=21939&page Index=1。所赋特征量值的不确定度由定值测量、均匀性和稳定性引入的不确定度分量合成得到。本标准物质的量值溯源至可作为任何一个量值基本单位的实体数基本单位“一”（符号：1）以及体积的国家法定计量单位升（L）。
按照国家计量技术规范JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》中对标准物质均匀性评估的技术要求，随机抽取一定数量的最小包装单元（可按随机数表所示方法抽样），采用数字PCR方法对抽出的各样品控制在同样的实验条件下进行均匀性测量[3]，研究结果表明本标准物质均匀性良好。并采用数字PCR方法对本标准物质进行初步稳定性研究，本标准物质可以稳定保存1个月以上，长期稳定性将会进行持续监测。
三、新冠假病毒标准物质使用方法和注意事项
本标准物质包装形式为200μL/管，经实验分析确定最小取样量为140μL，置于-70℃保存，采用干冰运输。
用户收到标准物质后，应检查标准物质是否处于冷冻状态，检查无误后方可使用。使用时，应在生物安全二级实验室（Biosafety Laboratory-2,简称BSL-2/P2）条件下操作。操作者须佩戴乳胶手套和防护口罩，将假病毒核糖核酸标准物质从冰箱中取出，待完全融化后，在生物安全柜中打开包装，推荐采用标准物质证书上列明的病毒核酸RNA提取试剂盒提取RNA后，进行逆转录PCR检测。使用后的标准物质包装瓶和移液器吸头等实验材料应在丢弃前进行高压灭菌处理。标准物质开瓶后应一次性使用，切勿反复冻融。
四、新冠假病毒标准物质的应用
新冠病毒传染性强、致病性极高，给研究和检测均带来了极大的威胁和挑战。在荧光定量PCR检测过程中，实验人员操作不当、试剂质量、设备差异等影响因素较多，可能导致假阴性和假阳性，需利用标准物质作为参考标准进行规范、评价和验证。相对于体外转录RNA标准物质，新冠假病毒核糖核酸标准物质与新冠自然源性病毒一样都是外壳蛋白包裹核酸，具备完整的病毒形态，且本标准物质具备新型冠状病毒重要特征基因，能够抵抗核酸酶降解，可以模拟真病毒从RNA提取至核酸扩增检测步骤全过程。因此，新冠假病毒核糖核酸标准物质可作为从新冠病毒核酸提取到核酸扩增检测全流程操作的测量标准，有利于检测方法的验证、实验室全流程质量控制和量值传递等。
在新冠假病毒核糖核酸标准物质对外发布不到半个月的时间，已向包括清华大学在内的北京、上海和郑州等地区的多个机构提供标准物质，期待未来为更多的高等院校、研究院所和生物高新技术企业提供精准的计量支撑。
五、结论
中国计量科学研究院生命科学计量团队成功研制安全性高、无生物污染性、可模拟真病毒从RNA提取至核酸扩增检测步骤全过程的新冠假病毒核糖核酸标准物质，为核酸提取到定量测量全流程操作提供测量标准，有助于核酸检测实验室质量控制和能力建设，解决了检测结果的量值溯源性，是我国在新冠病毒检测领域技术能力和话语权的又一重要体现。
参考文献
[1]Yoo, H.-B. et al. International Comparison of Enumeration-Based Quantification of DNA CopyConcentration Using Flow Cytometric Counting and Digital Polymerase Chain Reaction. Analytical Chemistry 88, 2016, 12169-12176
[2]Dong L, Zhou J, Niu C, et al. Highly accurate and sensitive diagnostic detection of SARSCo V-2 by digital PCR. med Rxiv 2020. http://h-s.doi.org.forest.naihes.cn/10.1101/2020.03.14.20036129
[3]阚莹，李红梅，孟凡敏，等.国家计量技术规范《标准物质定值的通用原则及统计学原理》JJF 1343-2012[S].北京：国家质量监督检验检疫总局发布
